ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การโคลนและการแสดงออกของยีนแลคเคสจากเชื้อเห็ดลม

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การโคลนและการแสดงออกของยีนแลคเคสจากเชื้อเห็ดลม
นักวิจัย : รักฤดี สารธิมา 
คำค้น : cloning , expression , Identification , Laccase , Lentinus polychrous , การจัดจำแนก , การแสดงออกของยีน , การโคลนยีน , เห็ดลม , แลคเคส
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2557
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=MRG5380083 , http://research.trf.or.th/node/7547
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

เชื้อเห็ดลมที่ผลิตแลคเคสที่มีศักยภาพสูงคัดแยกมาจากป่าในเขตภาคตะวันออกเฉียงเหนือ ได้รับการจำแนกอนุกรมวิธานจัดเป็น Lentinus polychrous โดยการวิเคราะห์รูปร่างลักษณะภายนอก ลักษณะและขนาดสปอร์ และโดยการเปรียบเทียบลำดับยีนบริเวณ internal transcribed spacer (ITS) ของ rDNA ยีนที่โค๊ดสำหรับแลคเคสโดยสมบูรณ์จากเชื้อเห็ดลมนี้ได้มาโดยเทคนิค RACE (Rapid amplification cDNA ends) ถูกโคลนและทำการแสดงออกในยีสต์ Pichia pastoris open reading frame ประกอบด้วยลำดับนิวคลีโอไทด์ขนาด 1,560 bp ถอดรหัสเป็นโปรตีนที่มีกรดอะมิโน 495 ตัว และมีเปปไทด์สัญญาณ (Signal peptide) ที่มีจำนวนกรดอะมิโน 24 ตัว โปรตีนสมบูรณ์นี้ (LP-Lac1 protein) มีความคล้ายคลึงมากกับ laccase C (AAW28938.1) และ laccase B (AAW28937.1) จาก เชื้อราไวท์รอท Trametes sp. 420 ด้วยเปอร์เซ็นต์ความเหมือน 81% และ 80% ตามลำดับ โปรตีนนี้ มีบริเวณจับอะตอมทองแดงครบ 4 บริเวณเหมือนกับแลคเคสทั่วไป บริเวณอนุรักษ์นี้มีความคล้ายคลึง กับโปรตีนกลุ่ม multicopper oxidases ทำนายได้ว่าโปรตีนมีขนาดมวลโมเลกุลประมาณ 55.6 kDa และมีค่า isoelectric point (pI) เท่ากับ 4.72 ประกอบด้วยกรดอะมิโนซีสเตอีนที่สำคัญ 5 ตัว เมื่อ เปรียบเทียบกับโปรตีนแลคเคสอื่นๆในฐานข้อมูล คาดว่า Cys-475 เป็นลิแกนด์สำหรับ type-1 copper และคาดว่าเกิดการสร้างพันธะไดซัลไฟล์ระหว่าง Cys-109 กับ Cys-510 และ Cys-141 กับ Cys-228 และพบตำแหน่งที่คาดว่าจะมีคาร์โบไฮเดรตมาเกาะอยู่ 8 ตำแหน่ง คือกรดอะมิโนตำแหน่งที่ 78, 203, 231, 274, 362, 366, 403 และ 458 เมื่อนำแลคเคสยีน LP-Lac1 cDNA มาแสดงออกใน ยีสต์ P. pastoris strain GS115 ภายใต้การเหนี่ยวนำของ AOX promoter พบว่ามีการแสดงออกของ ยีนแลคเคสในระดับต่ำ ในการทดลองต่อไปจะทำการเติมคอปเปอร์ซัลเฟตลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อ เหนี่ยวนำการผลิตแลคเคส และการหาอุณหภูมิที่เหมาะสมในการแสดงออก A highly efficient laccase-producing mushroom isolated from northeastern forest, Thailand was identified as Lentinus polychrous by its morphology and spores and by comparison of its internal transcribed spacer (ITS) rDNA gene sequence. The complete cDNA encoding laccase (LP-Lac1) from this white rot fungus was amplified by RACE-PCR, cloned and expressed in the culture supernatant of Pichia pastoris. The coding region consisted of 1,560 bp and encodes a protein of 495 amino acids with a signal peptide of 24 amino acids. The deduced amino acid sequence of the matured protein (LP-Lac1 protein) displayed high homology with laccase C (AAW28938.1) and laccase B (AAW28937.1) of Trametes sp. 420 with 81% and 80% respectively. It also contained 4 copper-binding conserved domains of typical laccase protein. The conserved domains of LP-Lac1 protein were predicted and analyzed with Conserved Domain Database (CDD). It revealed that LPLac1 protein contained typical conserved domains of multicopper oxidases. The calculated molecular mass is 55.6 kDa and isoelectric point of 4.72. There are 5 Cys residues presence in the deduced mature protein. Compared with other reported laccases, it can be concluded that Cys-475 is a ligand to the type-1 copper domain. Cys-109 and Cys-510 form disulfide bond, and Cys-141 and Cys-228 form the disulfide bond. Typical laccases are glycoproteins. LP-Lac1 protein has 8 potential N-glycosylation sites (Asn-x-Ser/Thr), at positions 78, 203, 231, 274, 362, 366, 403 and 458 of the deduced protein. LP-Lac1 cDNA was cloned into pPICZαB, and then expressed in P. pastoris GS115 strain under the inducible AOX promoter. However, low production was obtained with the expression construct containing laccase cDNA with its own signal and propeptide sequences. Further study of expression condition require for increasing the recombinant laccase yield by addition of laccase inducer, copper sulfate to the production medium and varying the temperatures.

บรรณานุกรม :
รักฤดี สารธิมา  . (2557). การโคลนและการแสดงออกของยีนแลคเคสจากเชื้อเห็ดลม.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
รักฤดี สารธิมา  . 2557. "การโคลนและการแสดงออกของยีนแลคเคสจากเชื้อเห็ดลม".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
รักฤดี สารธิมา  . "การโคลนและการแสดงออกของยีนแลคเคสจากเชื้อเห็ดลม."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2557. Print.
รักฤดี สารธิมา  . การโคลนและการแสดงออกของยีนแลคเคสจากเชื้อเห็ดลม. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2557.