ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

คุณลักษณะทางชีวเคมีและโมเลกุลของแลคเคส จากเห็ดหอมสายพันธุ์ทนร้อน (Lentinula edodes) และความสามารถในการฟอกจางสีสังเคราะห์

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : คุณลักษณะทางชีวเคมีและโมเลกุลของแลคเคส จากเห็ดหอมสายพันธุ์ทนร้อน (Lentinula edodes) และความสามารถในการฟอกจางสีสังเคราะห์
นักวิจัย : ปิยนันท์ ชมนาวัง
คำค้น : (ATM Design): Survivable Network , Biochemical and molecular characterization , Decolorized synthetic dyes , Laccase , Shiitake mushroom , การฟอกจางสีสังเคราะห์ , ลักษณะทางชีวเคมีและโมเลกุล , เห็ดหอม , แลคเคส
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2554
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=MRG5180295 , http://research.trf.or.th/node/6451
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

เพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตแลคเคสจากเห็ดหอมสายพันธุ์ทนร้อน การพัฒนาขั้นตอนและวิธีการทำให้แลคเคสจากเห็ดหอมลูกผสมสายพันธุ์ทนร้อนให้บริสุทธิ์ จากนั้นศึกษาคุณลักษณะทางชีวเคมีของเอนไซม์ และคุณลักษณะทางโมเลกุลของจีนที่ผลิตแลคเคส รวมทั้งทำการศึกษาความสามารถของแลคเคสบริสุทธิ์จากเห็ดหอมลูกผสมสายพันธุ์ทนร้อนในการฟอกจางสีสังเคราะห์ เห็ดหอมสายพันธุ์ KMUH1 เป็นสายพันธุ์ที่เหมาะสมต่อการนำมาผลิตแลคเคสที่ผลิตออกนอกเซลล์เนื่องจากสามารถผลิตแลคเคสได้สูงทุกอุณหภูมิที่ใช้ในการทดลองรวมทั้งให้ผลผลิตเอนไซม์สูง จากการศึกษาลักษณะและจลนพลศาสตร์ โดยเน้นคุณสมบัติการเร่ง และยับยั้งปฏิกิริยาของเอนไซม์ รวมทั้งเสถียรภาพของเอนไซม์ที่ยังไม่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ และที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ พบว่าแลคเคสสามารถทำงานได้ดีในช่วงพีเอชและอุณหภูมิที่เหมาะสมคือ 3.0-5.0 และ 30-60 0C ตามลำดับ โดยมีค่า แอคติวิตีเอนไซม์สูงสุดที่ พี เอช 5.0 และที่ 40 0C และเมื่อศึกษาผลของพี เอช ต่อความเสถียรของเอนไซม์ โดยแปรผันพี เอช 2 ถึง 11 เอนไซม์มีความเสถียรในช่วงพีเอช 3.0-6.0 ในขณะที่มีความเสถียรต่ออุณหภูมิของเอนไซม์ในสารละลายบัฟเฟอร์พีเอช 5.0 เมื่อบ่มที่ 37 0C นาน 16 ชั่วโมง การศึกษาผลของไอออนโลหะและตัวยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์เมื่อใช้ ABTS เป็นสับสเตรท พบว่าเอนไซม์ถูกยับยั้งด้วย 1 มิลลิโมลาร์ HgCl2 (60% การยับยั้ง) ในขณะที่สารอื่นสามารถกระตุ้นแอคติวิตีของเอนไซม์ได้ นอกจากนี้เอนไซม์สามารถถูกยับยั้งได้อย่างสมบูรณ์ด้วย 0.05 มิลลิโมลาร์โซเดียม เอไซด์ และ 0.1 มิลลิโมลาร์ซิสเตอีน การศึกษาสับสเตรทที่จำเพาะต่อการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์พบว่า ABTS และ syringaldazine, 2,6-dimethoxyphenol เป็นสับสเตรทที่เหมาะสำหรับแลคเคสในขณะที่ pyrogallol และ guaiacol ให้ค่าแอคติวิตีเอนไซม์ต่ำมาก นอกจากนี้แลคเคสไม่สามารถออกซิไดส์ veratryl alcohol และ tyrosine ได้ ซึ่งอาจจะต้องมีการใช้สาร mediator ช่วยในการเร่งปฏิกิริยา ผลการศึกษาจลนพลศาสตร์ของแลคเคส เมื่อใช้ ABTS เป็นสับสเตรท ได้ค่า Michaelis constant (Km) สำหรับปฏิกิริยาการออกซิไดซ์ ประมาณ 0.719 มิลลิโมลาร์ และค่า Vmax 0.557 มิลลิโมลต่อนาที เมื่อใช้ syringadine สามารถหาค่า Michaelis constant (Km) สำหรับปฏิกิริยาการออกซิไดซ์ ได้ค่าประมาณ 1.85 มิลลิโมลาร์ และค่า Vmax 1.268 มิลลิโมลต่อนาที และเมื่อใช้ 2,6-dimethoxyphenol สามารถหาค่า Michaelis constant (Km) สำหรับปฏิกิริยาการออกซิไดซ์ ได้ค่าประมาณ 1.49 มิลลิโมลาร์ และค่า Vmax 0.623 มิลลิโมลต่อนาที การทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ด้วยการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต การใช้ anion-exchange chromatography และ gel filtration พบว่าเอนไซม์มีความบริสุทธิ์สูงขึ้น 28 เท่า และได้ผลผลิตจากขั้นตอนการทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ 41% ในการตรวจสอบมวลโมเลกุลของแลคเคสโดยวิธี sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) พบว่ามีค่าประมาณ 60 กิโลดาลตัน และจากการศึกษาความสามารถของแลคเคสที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ในการฟอกจางสีสังเคราะห์ในกลุ่ม triphenyl methane ได้แก่ บลอมฟีนอลบลู, คริสตัลไวโอเล็ต, ฟีนอลเรด และ ฟูซิซิน สีสังเคราะห์ในกลุ่ม anthraquinone ได้แก่ indigo และสีสังเคราะห์ในกลุ่ม azo ได้แก่ methyl orange พบว่า เมื่อเพิ่มปริมาณแลคเคสความสามารถในการฟอกจางสีก็เพิ่มขึ้นตามไปด้วย และ เมื่อเพิ่มระยะเวลาในการบ่มนานขึ้น ความสามารถในการฟอกจางสีก็เพิ่มขึ้นตามไปด้วย และความสามารถในการฟอกจางสีสังเคราะห์มีค่าสูงในช่วงระยะเวลาแรกๆของการบ่ม ซึ่งอัตราการฟอกจางสีเพิ่มขึ้นตามระยะเวลาในการบ่ม นอกจากนี้ สีสังเคราะห์ที่ความเข้มข้นต่ำๆ แลคเคส สามารถฟอกจางสีสังเคราะห์ได้มาก และเมื่อเพิ่มความเข้มข้นของสีสังเคราะห์เพิ่มขึ้น ความสามารถในการฟอกจางสีมีค่าลดลงไปตามความเข้มข้นที่มาก The objective of the present study was to determine the optimal conditions for laccase production by thermo-tolerance shiitake mushroom (Lentinula edodes) hybrid in submerged culture, isolation, purification and characterization of laccase, and the utilization of the purified enzyme for decolorization of dyes. Laccase was isolated from the culture filtrate of Lentinula edodes strain KMUH1. Crude and purified laccase has optimum pH 3.0-5.0 and 30-60 0C as the optimum temperature. The pH stability of laccase was stable at pH 5.0 and the thermal stability was determined by incubating the enzyme at pH 5.0 37 0C for 16 hours. The effects of metal ions and inhibitors on laccase activity were tested by using ABTS as the substrate. The enzyme was strongly inhibited by 1 mM HgCl2 (60%) and was completely inhibited by 0.05 mM sodium azide and 0.1 mM L-cysteine. Substrate specificity was determined at the optimum pH for each substrate. ABTS, syringaldazine and 2,6-dimethoxyphenol were oxidized by laccase. Pyrogallol and guaiacol had the lowest activity enzyme. Veratryl alcohol and tyrosine were not oxidized. ABTS had the lowest Km and syringaldazine had the highest Vmax values. Homogeneous preparation of laccase from the culture filtrate of this fungus has been achieved using ammonium sulphate precipitation, anion exchange chromatography on DEAE and gel filtration chromatography on Sephadex G-100. The method gave 28 purification fold with 41% recovery of the enzyme activity. The laccase was concentrated and partially purified by ammonium sulphate precipitation, ultramembrane filtration, ion-exchange chromatography and gel filtration and its molecular weight determined by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was about 60,000 Dalton. The optimum pH for the decolonization of dyes was 5.0- the same as the optimum pH for oxidation of ABTS. Laccase was effective in the decolorization of chemically different dyes-triphenyl methane (bromophenol blue, crystal violet, phenol red and fucisine), anthraquinone (indigo) and azo dyes (methyl orange), without any mediators. Laccase decolorized dyes depending on laccase concentration, incubation time and dyes concentration.

บรรณานุกรม :
ปิยนันท์ ชมนาวัง . (2554). คุณลักษณะทางชีวเคมีและโมเลกุลของแลคเคส จากเห็ดหอมสายพันธุ์ทนร้อน (Lentinula edodes) และความสามารถในการฟอกจางสีสังเคราะห์.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ปิยนันท์ ชมนาวัง . 2554. "คุณลักษณะทางชีวเคมีและโมเลกุลของแลคเคส จากเห็ดหอมสายพันธุ์ทนร้อน (Lentinula edodes) และความสามารถในการฟอกจางสีสังเคราะห์".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ปิยนันท์ ชมนาวัง . "คุณลักษณะทางชีวเคมีและโมเลกุลของแลคเคส จากเห็ดหอมสายพันธุ์ทนร้อน (Lentinula edodes) และความสามารถในการฟอกจางสีสังเคราะห์."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2554. Print.
ปิยนันท์ ชมนาวัง . คุณลักษณะทางชีวเคมีและโมเลกุลของแลคเคส จากเห็ดหอมสายพันธุ์ทนร้อน (Lentinula edodes) และความสามารถในการฟอกจางสีสังเคราะห์. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2554.