ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การศึกษาติดตามต้นเชื้อ Lactobacillus sakei BCC 9546 ในการหมักแหนมด้วยโปรตีนเรืองแสง

หน่วยงาน สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การศึกษาติดตามต้นเชื้อ Lactobacillus sakei BCC 9546 ในการหมักแหนมด้วยโปรตีนเรืองแสง
นักวิจัย : เพลินพิศ ลักษณะนิล
คำค้น : Biological sciences , BT-B-02-NM-BC-4803 , Fermentation , Fluorescent proteins , Food , Food science and technology , Lactobacillus sakei , Nham , การหมัก , ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ , สาขาวิศวกรรมศาสตร์และอุตสาหกรรมวิจัย , แหนม , โปรตีนเรืองแสง
หน่วยงาน : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2549
อ้างอิง : http://www.nstda.or.th/thairesearch/node/2194
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

Lactobacillus plantarum BCC 9546 (Lp BCC 9546) เป็น Lactic acid bacteria ที่คัดแยกได้จากแหนมและสามารถใช้ประโยชน์เป็นต้นเชื้อในการผลิตแหนมได้เป็น อย่างดี แหนมที่ใส่ต้นเชื้อพบว่าจะมีคุณภาพดีและสามารถควบคุมคุณภาพได้คงที่สม่ำเสมอ มากขึ้นกว่าแหนมที่ไม่ใส่ต้นเชื้อ ปัจจุบัน Lp BCC 9546 สามารถผลิตจำหน่ายเป็นต้นเชื้อในอุตสาหกรรมแหนม แต่อย่างไรก็ตามทางด้านการศึกษายังขาดหลักฐานยืนยันชัดเจนเกี่ยวกับบทบาท หรือการเจริญเติบโตของต้นเชื้อนี้ในแหนมในระหว่างการหมัก ดังนั้นในโครงการนี้จึงพยายามสร้าง Lp BCC 9546 ลูกผสมที่สามารถเรืองแสงได้ เพื่อใช้ติดตามการเจริญเติบโตหรือการเปลี่ยนแปลงจำนวนของต้นเชื้อในระหว่าง การหมักแหนม เพื่อเป็นหลักฐานยืนยันบทบาทหรือความเกี่ยวข้องของต้นเชื้อในระหว่างการหมัก ในการศึกษานี้สามารถแบ่งเนื้อหาออกเป็น 4 ส่วนคือ ส่วนที่หนึ่งเป็นการศึกษาวิเคราะห์ลักษณะเบื้องต้นของต้นเชื้อเพื่อทราบและ เข้าใจธรรมชาติของ Lp BCC 9546 ที่จะสามารถวางแผนการสร้างลูกผสมเรืองแสงได้ต่อไป ส่วนที่สองเป็นส่วนที่ทำการสร้างและวิเคราะห์ลักษณะการเรืองแสงของลูกผสม ส่วนที่สามเป็นส่วนของการติดตามต้นเชื้อ Lp BCC 9546 และลูกผสมเรืองแสงในแหนม และส่วนที่สี่เป็นส่วนของการปรับปรุงการแสดงออกของโปรตีนเรืองแสงในเซลล์ต้น เชื้อเพื่อสามารถใช้งานได้ดีขึ้น ในการศึกษาลักษณะพันธุกรรมเบื้องต้นพบว่า Lp BCC 9546 มี endogenous plasmids ที่มี native form ที่มีขนาดเล็กระหว่าง 1-2 kb เป็นลักษณะเด่น แบคทีเรียมีความไวต่อยาปฏิชีวนะ erythromycin chloramphenicol และ tetracycline มีความสามารถในการรับการถ่ายทอดยีนโดยวิธี electroporation ด้วยพลาสมิด pRV85 ที่มีขนาดประมาณ 6.2 kb ซึ่งมียีนสร้างโปรตีนเรืองแสงสีเขียวและ erythromycin resistant gene อยู่ ให้ประสิทธิภาพการถ่ายทอดยีนนี้ที่ 102 cfu/?g DNA จากการสุ่มวิเคราะห์ดีเอนเอของ transformant clones ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ พบ 1 ใน 12 clones ที่ให้ชิ้นดีเอนเอโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ให้ชื่อว่า LpG#11 เซลล์ของ LpG#11 เมื่อถูกกระตุ้นด้วยคลื่นแสง UV และวิเคราะห์การเรืองแสงด้วยกล้อง fluorescence microscope หรือดูลักษณะ spectrum ด้วย spectrofluorometer พบว่ามีการเรืองแสงสีเขียวแตกต่างจาก Lp BCC 9546 ที่ไม่มีการเรืองแสง ลักษณะโปรตีนของ LpG#11มีโปรตีนขนาด 30 kDa ที่ใกล้เคียงกับขนาดของโปรตีนเรืองแสงสีเขียวที่แตกต่างจากโปรตีนของ Lp BCC 9546 อย่างไรก็ตามโคโลนีบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อของ LpG#11 และ Lp BCC 9546 ที่ถูกกระตุ้นด้วยแสง UV บน UV-box ยังไม่สามารถเห็นความแตกต่างกันด้วยตาอย่างชัดเจน ลักษณะการเจริญเติบโตและการผลิตกรดของ LpG#11 พบว่าโตช้ากว่า Lp BCC 9546 ในช่วง log phase โดยการผลิตกรดมีความสัมพันธ์โดยตรงกับปริมาณเซลล์ ลักษณะการคงอยู่ของพลาสมิด pRV85 ในเซลล์ LpG#11 นั้นพบว่าเมื่อสุ่ม 100 โคโลนีของ LpG#11มาทำการ subculture ทุกวันบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มียาปฏิชีวนะ พบการคงอยู่ของพลาสมิดในเซลล์เป็นดังนี้ 100% 72% และ 42% ในวันที่ 8 9 และ 10 ของการ subculture ตามลำดับ การศึกษาติดตามต้นเชื้อในระหว่างการหมักแหนมนั้นได้ทำการเตรียมแหนมแล้วแบ่ง ออกเป็น 3 ส่วน คือแหนมที่ไม่ใส่ต้นเชื้อ แหนมที่ใส่ต้นเชื้อ Lp BCC 9546 และแหนมที่ใส่ต้นเชื้อลูกผสม LpG#11 ผลการศึกษาพบว่าปริมาณแบคทีเรียทั้งหมดที่พบในแหนมทั้งสามชนิดไม่มีความแตก ต่างกัน แต่แหนมที่ไม่ใส่ต้นเชื้อจะมีความหลากหลายของลักษณะโคโลนีที่แตกต่างกัน มากกว่าแหนมที่ใส่ต้นเชื้อ และเมื่อสังเกตลักษณะเฉพาะของโคโลนีที่คล้ายโคโลนีของ Lactobacillus ก็พบว่าในแหนมที่ใส่ต้นเชื้อจะพบลักษณะโคโลนีแบบนี้เป็นลักษณะเด่นในเชิง ปริมาณสูงตั้งแต่ชั่วโมงที่ 20 ขึ้นไป ส่วนของการผลิตกรดนั้นแหนมที่ใส่ต้นเชื้อ Lp BCC 9546 จะมีการผลิตกรดที่มากกว่าแหนมที่ใส่ต้นลูกผสม LpG#11 และแหนมที่ไม่ใส่ต้นเชื้อโดยให้ค่า pH และ % total acid ที่สอดคล้องกัน ลักษณะความแน่นเนื้อและสีของแหนมทั้งสามชนิดพบว่าไม่มีความแตกต่างกัน ถึงแม้ว่าลักษณะการเจริญเติบโตของลูกผสม LpG#11 นั้นจะมีการเจริญที่ช้ากว่า Lp BCC 9546 ในช่วงแรกของการเจริญเติบโตซึ่งเป็นส่วนสำคัญต่อการแข่งขันกับแบคทีเรีย ธรรมชาติที่มีอยู่ในแหนมก่อนการหมักจึงทำให้ LpG#11 เป็นตัวแทนการศึกษาบทบาทของ Lp BCC 9546 ยังไม่ได้โดยสมบูรณ์ แต่จากการติดตามลูกผสม LpG#11 บนจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่มียาปฏิชีวนะและลักษณะการเรืองแสงของเซลล์ก็ทำให้ สามารถยืนยันการคงอยู่และสามารถติดตามการเพิ่มจำนวนของเซลล์ลูกผสมในระหว่าง การหมักแหนมได้อย่างชัดเจนตลอดระยะเวลาการศึกษา ในการปรับปรุงการแสดงออกของโปรตีนเรืองแสงใน Lp BCC 9546 ให้ดีขึ้นและใช้ประโยชน์ได้สะดวกยิ่งขึ้นนั้นได้ทำการเปลี่ยนยีนโปรตีนเรือง แสงสีเขียวเป็นสีแดงเนื่องจากโปรตีนเรืองแสงสีเขียวยังต้องการแสง UV กระตุ้นให้เกิดการเรืองแสงแต่ถ้าเปลี่ยนเป็นโปรตีนเรืองแสงสีแดงจะสามารถใช้ visible light ปกติกระตุ้นการเรืองแสงได้ ดังนั้นจึงทำการสร้างพลาสมิดลูกผสม pRVRFP โดยการแทนที่ยีนสร้างโปรตีนเรืองแสงสีเขียวด้วยยีนสร้างโปรตีนเรืองแสงสีแดง ชนิด tetramer แล้วนำเข้าเซลล์ E. coli JM109 เพื่อเพิ่มปริมาณพลาสมิดลูกผสม E. coli pRVRFP ลูกผสมนี้แสดงลักษณะโคโลนีสีแดงบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ต่างจากโคโลนีของ E. coli JM109 อย่างชัดเจนที่ 48 ชั่วโมงขึ้นไป แต่เมื่อนำพลาสมิด pRVRFP ใส่เข้าไปในเซลล์ของ Lp BCC 9546 ได้ลูกผสม Lp-RFP ที่ถูกยืนยันการมีอยู่ของพลาสมิด pRVRFP อย่างชัดเจน แต่ไม่พบลักษณะโคโลนีสีแดงหรือการแสดงออกใดของการเรืองแสงสีแดงของเซลล์ลูก ผสมนี้ อาจเป็นไปได้ว่าการแสดงออกหรือการรวมตัวกันของ tetramer ของโปรตีนเรืองแสงสีแดงในเซลล์ของ Lp BCC 9546 ซึ่งมี endogenous plasmid อยู่นั้นยังไม่ดีพอ ดังนั้นจึงพยายามกำจัด endogenous plasmid (plasmid curing) นี้ออกไป โดยใช้ยาปฏิชีวนะ Novobiocin ผลการทดลองได้ 4 clones ที่ไม่มี endogenous plasmid ขนาดเล็กนี้โดย clone#5 ถูกเลือกเป็นตัวแทนในการศึกษาต่อไปให้ชื่อว่า Lp5C จากนั้นใส่พลาสมิด pRV85 และ pRVRFP เข้าไปในเซลล์ Lp5C ได้ลูกผสม Lp5C-GFP และ Lp5C-RFP เซลล์ลูกผสม Lp5C-RFP ยังคงไม่พบการเรืองแสงสีแดงแต่อย่างไร แต่เซลล์ลูกผสม Lp5C-GFP พบการเรืองแสงสีเขียวที่ชัดเจนขึ้นของโคโลนีบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อเมื่อ กระตุ้นด้วยแสง UV ในการเปรียบเทียบลักษณะการเจริญเติบโตพบว่า Lp5C-GFP มีลักษณะการเจริญเติบโตที่ใกล้เคียงกับ Lp5C มากกว่าลักษณะการเจริญของ LpG#11 เปรียบเทียบกับ Lp BCC 9546 นอกจากนี้การคงอยู่ของพลาสมิด pRV85 ในเซลล์ Lp5C ก็แสดงความสามารถการคงอยู่ในเซลล์ได้นานกว่าในเซลล์ของ Lp BCC 9546 โดยพบการคงอยู่ 100% 80% และ 74%ในวันที่ 12 13 และ 14 ของการ subculture ตามลำดับ Endogenous plasmid ขนาดเล็กที่มีอยู่ในเซลล์ของ Lp BCC 9546 นี้ถูกนำมาศึกษาวิเคราะห์ถึงลำดับเบสเพื่อสามารถเข้าใจบทบาทหน้าที่ของพลา สมิดและนำมาประยุกต์ใช้ประโยชน์ต่อไป พลาสมิดขนาดเล็กนี้ถูกสกัดแยกแล้วทำให้บริสุทธิ์และวิเคราะห์ด้วยเอนไซม์ตัด จำเพาะชนิดต่างๆ เอนไซม์ Sph I สามารถตัดแยกพลาสมิด ออกเป็น 2 ชิ้นโดยชิ้นใหญ่มีขนาดประมาณ 2 kb และชิ้นเล็กประมาณ 1 kb จากนั้นได้ทำการต่อดีเอนเอแต่ละส่วนกับ pUC18 แล้วใส่เข้าไปใน E. coli JM109 คัดเลือก recombinant clones เป้าหมายและเพิ่มขยายจำนวนดีเอนเอแล้วนำไปหาลำดับดีเอนเอของแต่ละส่วน ปัจจุบันได้ข้อมูลลำดับดีเอนเอในส่วนของชิ้นใหญ่แล้วคือ 2,282 bps ที่มีความคล้ายคลึงกับ cryptic plasmid ที่พบใน Lactobacilli ชนิดอื่น โดยเกี่ยวข้องกับยีนสร้างโปรตีนในการเพิ่มขยายจำนวนของพลาสมิด ในส่วนของดีเอนเอชิ้นเล็กนั้นขณะนี้กำลังศึกษาอยู่ การทราบข้อมูลลำดับดีเอนเอทั้งหมดของพลาสมิดขนาดเล็กนี้จะทำให้สามารถเข้าใจ บทบาทและหน้าที่ของพลาสมิดนี้และจะเป็นประโยชน์ในการสร้าง cloning vector สำหรับ L. plantarum หรือ lactic acid bacteria ชนิดอื่นต่อไปได้ในอนาคต

บรรณานุกรม :
เพลินพิศ ลักษณะนิล . (2549). การศึกษาติดตามต้นเชื้อ Lactobacillus sakei BCC 9546 ในการหมักแหนมด้วยโปรตีนเรืองแสง.
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
เพลินพิศ ลักษณะนิล . 2549. "การศึกษาติดตามต้นเชื้อ Lactobacillus sakei BCC 9546 ในการหมักแหนมด้วยโปรตีนเรืองแสง".
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
เพลินพิศ ลักษณะนิล . "การศึกษาติดตามต้นเชื้อ Lactobacillus sakei BCC 9546 ในการหมักแหนมด้วยโปรตีนเรืองแสง."
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ, 2549. Print.
เพลินพิศ ลักษณะนิล . การศึกษาติดตามต้นเชื้อ Lactobacillus sakei BCC 9546 ในการหมักแหนมด้วยโปรตีนเรืองแสง. ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ; 2549.