ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การผลิตโปรตีนของไวรัสไข้เลือดออกโดยใช้ Baculovirus Expression Insect cell System

หน่วยงาน สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การผลิตโปรตีนของไวรัสไข้เลือดออกโดยใช้ Baculovirus Expression Insect cell System
นักวิจัย : กนกวรรณ พุ่มพุทรา , Kanokwan Poomputsa
คำค้น : Baculovirus Expression Insect Cell System , Biological sciences , BT-B-06-2E-20-101 , Clinical medicine , Dengue viruses , ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ , สาขาวิทยาศาสตร์การแพทย์ , แบคคิวโลไวรัส , ไข้เลือดออก
หน่วยงาน : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2542
อ้างอิง : http://www.nstda.or.th/thairesearch/node/1753
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

ไข้เลือดออกเกิดจากการติดเชื้อของไวรัสเดงกี่ ผู้ป่วยที่ติดเชื้อขั้นรุนแรง มีอาการไข้เลือดออก (Dengue Hemorrhagic Faver, DHF) หรืออาการช็อก (Dengue Shock Syndrome, DSS) ซึ่งเป็นสาเหตถุสำคัญของการเสียชีวิตของผู้ป่วยเป็นจำนวนมาก เป็นปัญหาสาธารณสุขที่สำคัญอย่างหนึ่งของประเทศไทย การตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อของไวรัสไข้เลือดออกในระยะเริ่มต้น มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการรักษาและการป้องกันการระบาดของโรคดังนั้นการมี ชุดตรวจวินิจฉัยที่มีประสิทธิภาพและใช้ได้โดยง่ายในห้องปฏิบัติการโดยทั่วไป จึงมีความสำคัญอย่างยิ่งซึ่งการผลิตชุดตรวจวินิจฉัยเพื่อตรวจสอบการมี แอนติบอดีต่อไวรัสเดงกี่ที่แสดงถึงการติดเชื้อไวรัสชนิดนี้นั้น จำเป็นต้องมีแอนติเจนที่มีคุณภาพดี และผลิตได้โดยง่าย ดังนั้นการใช้ส่วนโปรตีนของไวรัสที่ได้จากการใช้เทคโนโลยีชีววิศวกรรม โดยใช้เซลล์เจ้าบ้านชนิดต่างๆ เช่น แบคทีเรีย หรือเซลล์สัตว์ชั้นสูง จึงเป็นอีกทางเลือกหนึ่งในการผลิตแอนติเจเพื่อใช้ในชุดตรวจวินิจฉัย โครงการนี้เป็นส่วนหนึ่งของโครงการการผลิตโปรตีนของไวรัสไข้เลือดออกโดยใช้ เทคโนโลยีดังกล่าว โดยใช้ Baculovirus Expression Insect Cell System เพื่อทำการผลิต recombinant proteins ของไวรัสเดงกี่ส่วน envelope และ non-structural protein โดยการนำยีนที่ใช้สังเคราะห์โปรตีน 2 ชนิด มาทำการต่อเข้ากับจีโนมของแบคคิวโลไวรัส ซึ่งการศึกษานี้ได้เลือกใช้ E.coli-based shuttle vector เมื่อนำแบคคิวโลไวรัสที่ผ่านกระบวนการพันธุวิศวกรรมนี้มา infect เข้าสู่เซลล์แมลง < Spodoptera frugiperda> จะมีการแสดงออกของยีนที่ต้องการในเซลล์แมลง ทำให้เซลล์มีการสังเคราะห์ recombinant envelope protein และ recombinant NS1 protein การตรวจสอบ recombinant protein ทั้งสองชนิดจากเซลล์แมลงที่ถูก infect โดย recombinant baculovirus นั้นใช้เทคนิค Western blot analysis โดยในการศึกษานี้ใช้ทั้งซีรั่มผู้ป่วยติดเชื้อไวรัสไข้เลือดออกและโมโนโคลน อลแอนติบอดีแอนติบอดีที่จำเพาะต่อโปรตีนทั้งสอง ผลการทดสอบพบแถบโปรตีนที่จำเพาะกับแอนติบอดีทั้งสองชนิดที่คาดว่าเป็น recombinant envelope protein และ recombinant NS1 protein ซึ่งมีขนาดมวลโมเลกุลประมาณ 58.8 kDa และ 49.8 kDa ตามลำดับ จากการเปรียบเทียบขนาดมวลโมเลกุลของ recombinant protein กับโปรตีนมาตรฐาน การศึกษาหาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิต recombinant protein ในโครงการนี้ มุ่งเน้นการหาปริมาณไวรัสที่เหมาะสมในการนำมา infect เซลล์แมลงที่เจริญในช่วง early exponential phase ที่มีความหนาแน่นเซลล์ 1x106 cells/ml และช่วงเวลาที่เหมาะสมในการเก็บเกี่ยวโปรตีน จากการใช้ปริมาณ recombinant baculovirus ปริมาณต่างกัน ได้แก่ MOI 0.1 1 5 และ 10 พบว่าปริมาณที่เหมาะสมสำหรับ recombinant E baculovirus คือ MOI 0.1 หรือ 1 โดยเก็บเกี่ยวโปรตีนในวันที่ 4 ส่วนปริมาณที่เหมาะสมสำหรับ recombinant NS1 baculovirus คือ MOI 1-10 และเวลาที่เหมาะสมในการเก็บเกี่ยวโปรตีน คือ วันที่5 สำหรับการสกัด recombinant protein ให้บริสุทธิ์นั้น ได้ทำการทดลองสกัด recombinant envelope protein โดยอาศัยคุณสมบัติการเป็น Histidine tagged protein เพื่อใช้ Metal affinity chroatography นอกจากนี้ยังใช้คุณสมบัติการจับได้กับ concanavalin A เพื่อใช้กับ ConA affinity chromatography แต่ผลการทดสอบพบว่า chromatography ทั้งสองแบบ ยังไม่สามารถนำมาใช้สกัด recombinant envelope protein ได้ จึงยังต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมต่อไป ส่วนการสกัด recombinant NS1 protein นั้นใช้คุณสมบัติของการเป็น fusion protein ที่มี Histidine 6 โมเลกุลเช่นเดียวกัน ในการเลือก Metal chromatography เพื่อการสกัด และใช้ Co2+ ในสภาวะ denature (มี 8 M Urea เป็นส่วนประกอบ) ซึ่งสามารถสกัด recombinant NS1 protein ให้บริสุทธิ์ได้ และจากการทดลอง renature โปรตีนบริสุทธิ์ที่สกัดได้ โดยการ dialysis ในบัฟเฟอร์ที่มี 0.5 M L-arginine จึงสามารถ renature โปรตีนกลับคืนมาในสารละลายได้ประมาณ 50% การประเมินผลผลิต recombinant protein ในระดับปริมาตรการผลิต 100 มล. ใน shake flask พบว่าเซลล์แมลงมีการผลิต recombinant envelope protein ประมาณ 0.6 mg จากการเปรียบเทียบความเข้มข้นของแถบโปรตีนบน Western blot กับความเข้มของแถบโปรตีนที่นำมาทำกราฟมาตรฐานจากการใช้ recombinant envelope protein สกัดบริสุทธิ์จากแบคทีเรียที่ความเข้มข้นต่างๆ ส่วนปริมาณของ recombinant NS1 protein นั้นได้จากการวัดปริมาณโปรตีนบริสุทธิ์ในสารละลายทีสกัดได้ พบว่ามีปริมาณเมื่อรวมกับโรตีนที่ตกตะกอนประมาณ 0.6 mg จากการเพาะเลี้ยงเซลล์ 100 ml อย่างไรก็ตามเชื่อว่าคงมีโปรตีนส่วนสูญเสียไปในระหว่างการสกัดด้วย ดังนั้นปริมาณการผลิต recombinant NS1 protein น่าจะมากกว่ามาณข้างต้น

บรรณานุกรม :
กนกวรรณ พุ่มพุทรา , Kanokwan Poomputsa . (2542). การผลิตโปรตีนของไวรัสไข้เลือดออกโดยใช้ Baculovirus Expression Insect cell System.
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
กนกวรรณ พุ่มพุทรา , Kanokwan Poomputsa . 2542. "การผลิตโปรตีนของไวรัสไข้เลือดออกโดยใช้ Baculovirus Expression Insect cell System".
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ.
กนกวรรณ พุ่มพุทรา , Kanokwan Poomputsa . "การผลิตโปรตีนของไวรัสไข้เลือดออกโดยใช้ Baculovirus Expression Insect cell System."
    ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ, 2542. Print.
กนกวรรณ พุ่มพุทรา , Kanokwan Poomputsa . การผลิตโปรตีนของไวรัสไข้เลือดออกโดยใช้ Baculovirus Expression Insect cell System. ปทุมธานี : สำนักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ; 2542.