ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การศึกษาเชิงโครงสร้างของการรวมตัวและการเกิดรูรั่วโดยโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงจากแบคทีเรีย Bacillus thuringensis

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การศึกษาเชิงโครงสร้างของการรวมตัวและการเกิดรูรั่วโดยโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงจากแบคทีเรีย Bacillus thuringensis
นักวิจัย : ชนันท์ อังศุธนสมบัติ
คำค้น : Crystallisation , Electron crystallography , larvicidal activity , Membrane-associated pore complex , mutagenesis , Trimeric structure , การรวมตัว , การศึกษาเชิงโครงสร้าง , การเกิดรูรั่ว , แบคทีเรีย Bacillus thuringiensis ATR FTIR , โปรตีนฆ่าลูกน้ำยุง
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2554
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=BRG5080003 , http://research.trf.or.th/node/2625
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

ความเป็นพิษของโปรตีนสารพิษที่ฆ่าแมลง (Cry -endotoxins) จากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis นั้นมีความเชื่อว่าโปรตีนดังกล่าวสามารถทำให้เกิดรูรั่วและการแตกของเซลล์บุเยื่อกระเพาะแมลงตัวอ่อนเป้าหมาย ในรายงานนี้เราได้ศึกษาวิเคราะห์โครงสร้างจตุรภูมิโดยวิธี Electron crystallography ของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุง Cry4Ba ในเยื่อหุ้มไขมัน DMPC ซึ่งได้จากการตกผลึกโปรตีนด้วยวิธี Detergent dialysis พบว่า มีผลึกสองมิติ (2D crystal) อย่างน้อย 2 ชนิด และจากการวิเคราะห์ภาพฉายมุมบนผลึกโปรตีนที่ได้พบว่า ผลึกทั้งคู่ประกอบขึ้นจากสามโมเลกุล (Trimer) ของโปรตีน Cry4Ba ซึ่งผลึกรูปหนึ่งมีรูปลักษณ์คล้ายคลึงกับกังหันสามใบ (Three-bladed pinwheel) ในขณะที่ผลึกอีกรูปหนึ่งเป็นรูปใบพัด (Propeller) โดยที่มีรูอยู่ที่ตรงใจกลางของโมเลกุลอย่างเห็นได้ชัดซึ่งมีความเป็นไปได้ที่จะเป็นรูรั่วที่โปรตีนดังกล่าวนี้สร้างขึ้น นอกจากนี้เราได้ศึกษาบทบาทหน้าที่ของเกลียวอัลฟาที่ 7 (-helix 7) ซึ่งค่อนข้างอนุรักษ์ (Conserved) โดยได้ศึกษาการเหนี่ยวนำโครงรูปของเปปไทด์สังเคราะห์ Cry4Ba-7 ขนาด 27 กรดอะมิโนในชั้นเยื่อหุ้มไขมันต่างชนิดกันด้วยวิธี ATR-FTIR spectroscopy และวิธี H+/D+ exchange ซึ่งพบว่า เมื่อ Cry4Ba-7 อยู่ในชั้นเยื่อหุ้มไขมัน DMPC หรือ DDPC เปปไทด์ดังกล่าวจะมีโครงรูปเป็นได้ทั้งเกลียวอัลฟาและบีต้า (-conformation) ซึ่งจะขึ้นอยู่กับอัตราส่วนของเปปไทด์ต่อเยื่อหุ้มไขมันที่ใช้ อย่างไรก็ตามพบว่า เมื่อเปปไทด์นี้อยู่ในชั้นเยื่อหุ้มไขมันที่เป็นประจุลบ อันได้แก่ DMPG นั้น มันจะมีโครงรูปเป็นเกลียวอัลฟาเท่านั้น และยังพบเพิ่มเติมว่า โครงรูปบีต้านั้นจะฝังตัวลงในชั้นเยื่อหุ้มไขมัน DMPC ~90% และมีมุมเอียง ~45o แต่โครงรูปเกลียวอัลฟานั้นจะวางตัวในแนวราบบนชั้นผิวเยื่อหุ้มไขมันดังกล่าว ซึ่งให้ผลสอดคล้องกับการศึกษาเปปไทด์ดังกล่าวใน DMPC เช่นกันด้วยวิธี MD simulations นอกจากนี้เราได้สร้างโปรตีนกลายพันธุ์ Cry4Ba-R203Q ขนาด 65 kDa เพื่อศึกษาโครงสร้างจตุรภูมิที่มีขนาดเต็มส่วนโดยได้กำจัด Arginine ที่ตำแหน่ง 203 ซึ่งเป็นจุดตัดโดย Trypsin ทิ้งไป ในการนี้ได้แยกบริสุทธิ์และตกผลึกโปรตีนดังกล่าวด้วยวิธี Sitting-drop vapor diffusion พบว่า ผลึกโปรตีนที่ได้เป็นแบบ Rhombohedral space group R32 ซึ่งมีค่า Unit-cell parameters a = b = 184.62 Å และ c = 187.36 Å และจากการทำ Diffraction โดยใช้ Synchrotron radiation X-ray ที่ระดับอย่างน้อย 2.07 Å resolution จะได้ Overall Rsym = 9.1% ที่ความสมบูรณ์ (Completeness) = 99.9% และเมื่อวิเคราะห์เบื้องต้นพบว่า ในแต่ละ Asymmetric unit จะมีโปรตีนกลายพันธุ์ดังกล่าวอยู่เพียงหนึ่งโมเลกุลโดยมีค่า VM coefficient = 4.33 Å3 Da-1 และค่า Solvent content = 71% The insecticidal character of Bacillus thuringiensis Cry -endotoxins is believed to be caused by their capability to generate lytic pores in the target larval midgut membrane. Herein, membrane-associated structures of the 65-kDa mosquito-active Cry4Ba toxin was analysed by electron crystallography. 2D crystals of the oligomeric toxin complex have been captured in two distinct conformations via detergent dialysis. Both complexes appeared to be trimeric; one crystal form revealed a symmetrical three-bladed pinwheel-like shape whilst the other form revealed a propeller-like conformation displaying an obvious hole in the center region, conceivably implying the open state of the pore. We have also characterised the lipid-induced conformation of a 27-residue Cry4Ba-7 peptide in different phospholipid membranes. ATR-FTIR results showed that the peptide in DMPC or DDPC adopted both -helical and -structure, present in varying proportions depending on the peptide-to-lipid ratio, but only -helical conformation was observed in anionic DMPG membranes. H+/D+ exchange results showed protection of ~90% in DMPC for the -form, with a peptide carbonyl average tilt angle of ~45o with respect to the bilayer normal, whilst the -helical form was found preferentially on the membrane surface. 10-ns MD simulations of the 7 peptide in DMPC bilayers supported the stability of -helical and -conformations for the membrane-associated and membrane-inserted states, respectively. Moreover, the 65-kDa functional form of the Cry4Ba-R203Q mutant was generated for crystallization by eliminating the tryptic cleavage site at Arg203. The 65-kDa trypsin-resistant fragment has been purified and crystallized using the sitting-drop vapor diffusion method. The crystals belong to the rhombohedral space group R32 with unit-cell parameters a = b = 184.62 Å, c = 187.36 Å. Diffraction data were collected to at least 2.07 Å resolution using synchrotron radiation X-ray and gave a data set with an overall Rsym of 9.1% and a completeness of 99.9%. Preliminary analysis indicates that one asymmetric unit contains one molecule of the active full-length mutant with the VM coefficient and the solvent content of 4.33 Å3 Da-1 and 71%, respectively.

บรรณานุกรม :
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . (2554). การศึกษาเชิงโครงสร้างของการรวมตัวและการเกิดรูรั่วโดยโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงจากแบคทีเรีย Bacillus thuringensis.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . 2554. "การศึกษาเชิงโครงสร้างของการรวมตัวและการเกิดรูรั่วโดยโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงจากแบคทีเรีย Bacillus thuringensis".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . "การศึกษาเชิงโครงสร้างของการรวมตัวและการเกิดรูรั่วโดยโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงจากแบคทีเรีย Bacillus thuringensis."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2554. Print.
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . การศึกษาเชิงโครงสร้างของการรวมตัวและการเกิดรูรั่วโดยโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงจากแบคทีเรีย Bacillus thuringensis. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2554.