ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของเอ็นไซม์ไคติเนสที่สกัดจากเชื้อ Vibrio carchariae แต่แสดงออกใน E. coli: การนำผลิตผลจากการย่อยสลายไคตินโดยขบวนการชีวภาพมาใช้ประโยชน์ทางการแพทย์

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของเอ็นไซม์ไคติเนสที่สกัดจากเชื้อ Vibrio carchariae แต่แสดงออกใน E. coli: การนำผลิตผลจากการย่อยสลายไคตินโดยขบวนการชีวภาพมาใช้ประโยชน์ทางการแพทย์
นักวิจัย : วิภา สุจินต์
คำค้น : chitin hydrolysis , chitinase chitinase A , cloning , expression , Vibrio carchariae
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2549
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=TRG4580058 , http://research.trf.or.th/node/1726
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

งานวิจัยนี้ได้ทำการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ไคติเนส เอ ที่ผลิตจากเชื้อแบคทีเรียในทะเลคือเชื้อ Vibrio carchariae: โดยใช้เทคนิค HPLC-ESI MS เทคนิคนี้สามารถแยกผลิตผลที่ได้จากการสลายไคตินและไคโตโอลิโกแซคคาร์ไรด์ที่มีขนาดต่าง ๆ กันได้พร้อมกัน โดยผลิตผลที่ได้ให้โครงสร้างแบบบีต้าก่อนอัลฟาสนับสนุนกลไกแบบ “retaining mechanism” เอนไซม์สามารถใช้สารตั้งต้นขนาดเล็กที่สุดคือไตรเมอร์และผลิตผลหลักของปฏิกิริยาคือ [GlcNAc]2 การศึกษาคุณสมบัติทางจลศาสตร์ของเอนไซม์โดยทดสอบกับสารตั้งต้นชนิดต่าง ๆ พบว่าเอนไซม์มีความชอบต่อสารตั้งต้นมากขึ้นเมื่อความยาวของหน่วย GlsNAc เพิ่มขึ้น ผลการทดลองนี้สอดคล้องกับข้อสรุปที่ว่าเอนไซม์มีตำแหน่งจับกับหน่วย GlcNAc บนไคตินโพลีเมอร์มากกว่า 4 ตำแหน่ง การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ในการสังเคราะห์โอลิโกแซคคาร์ไรด์จากหน่วยย่อยขนาดเล็ก ภายใต้สภาวะที่ทดสอบโดยใช้ pNP-[GlcNAc]2 เป็นสารตั้งต้นพบว่าเอนไซม์สามารถสังเคราะห์ [GlcNAc]3 และ [GlcNAc]4 เป็นผลิตผลหลัก การวิเคราะห์มวลของเพปไทด์ของเอนไซม์ที่ถูกย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซินโดยเครื่อง MALDI-TOF MS และ nanoESI MS พบว่าตรงกับมวลของเพปไทด์ที่คำนวณได้จากลำดับกรดอะมิโนของโพลีเพปไทด์ที่แปลระหัสจากลำดับนิวคลิโอไทด์ของยีนไคติเนส เอ การทำนายโครงสร้างทุติยภูมิพบว่าเอนไซม์ไคติเนส เอ มีโครงสร้างคล้ายคลึงกับโครงสร้างของ Chi A จากเชื้อแบคทีเรีย Serratia marcescens โดยประกอบด้วยสามโดเมนหลัก โดเมนที่ 1 คือ N-terminal chitin binding domain ต่ออยู่กับส่วน hinge สั้น ๆ ที่เชื่อมกับโดเมนที่ 2 คือ catalytic (?/?)8 TIM barrel domain ประกอบด้วยเกลียวอัลฟาและสายบีต้าอย่างละ 8 สาย โดเมนนี้ถูกคั้นด้วยโดเมนที่ 3 คือ Small insertion domain ผลการทดลองที่ผ่านมาพบว่ายีนไคติเนส เอ ที่แยกจากจีโนมของเชื้อ Vibrio carchariae ถอดระหัสให้กรดอะมิโน 850 ตัวได้สายโพลีเพปไทด์ต้นตอมี Mr = 95,000 แต่มวลโมเลกุลของเอนไซม์ที่ผลิตโดยเชื้อแบคทีเรียที่ได้จากการวิเคราะห์โดยวิธี MALDI-TOF MS ให้ค่า Mr = 62,698 แสดงว่าโปรตีนตั้งตอที่สร้างขึ้นภายในเซลล์ของแบคทีเรียนี้ถูกย่อยด้วยเอนไซม์โปรติเอสให้มีขนาดเล็กลงจึงจะทำงานได้ โดยได้ทำนายตำแหน่งย่อยอยู่ระหว่างกรดอะมิโน Arg597-Lys598 ผลการทดลองนี้นำไปสู่การออกแบบไพรเมอร์เพื่อการโคลนยีนไคติเนส เอ ที่ทำงานได้และได้ทดสอบการแสดงออกของยีนในระบบ QlAExpress ในเชื้อ E. coli M15 พบว่าริคอมบิแนนท์โปรตีนที่ผลิตได้มีน้ำหนักโมเลกุล 63 kDa และมีกรดอะมิโนฮีทิดีนติดอยู่ 6 ตัวที่ ด้านปลายคาร์บอกซี ไคติเนสที่สร้างขึ้นมีความสามารถในการย่อย glycol-chitin และ colloidal chitin ได้ดี การทดสอบการตกผลึกโปรตีนพบว่าริคอมพิแนนท์ไคติเนส เอ สามารถเกิดผลึกได้ที่อุณหภูมิ 15? ซ ที่สภาวะบัฟเฟอร์คือ 0.1 M โซเดียม อะซิเตท พีเอช 4.6 ที่มี 10% PEG 400 และ 0.125 M CaCl2 เป็นองค์ประกอบ การวิเคราะห์ทางโครงสร้างเบื้องต้นพบว่าผลึกโปรตีนให้ค่าการหักเหของรังสีเอกซ์ โดยมีค่า resolution = 2.14 ? ความสมบูรณ์ของข้อมูล = 97.2% มี space group เป็นเตตระโกนอล แบบ {4122, หรือ P4322 และมีค่าหน่วยเซลล์คือ a = 127.64 b = 127.64 และ c = 171.42 ? The enzymic properties of chitinase A from a marine bacterium, V. carchariae, were studied using HPLC and electrospray MS. This combination allowed separation of ?-and ?- anomers and simultaneous monitoring of all chitooligosaccharides produced. Chitinase A primarily produced ?-anomeric products, indicating that it catalysed hydrolysis through a retaining mechanism. The enzyme required a minimum of two glycosidic bonds for hydrolysis, producing (GlcNAc)2 as the major end products. The kinetics of the hydrolytic activity of chitinase A were determined with various chitooligosaccharid substrates and showed a greater affinity towards higher molecular weight chitooligosaccharides. The subsite structure of V. carchairae chitinase A was compatible with >4 GlcNAc subsites. The enzyme also catalysed transglycosylation reactions. Under given conditions, the synthetic products (GlcNAc)3 and (GlcNAc)4 were observed when using pNP-(GlcNAc)2 as substrate. Peptide masses of the native enzyme identified from MALDI-TOF or nanoESIMS were identical with the putative amino acid sequence translated from the corresponding nucleotide sequence of V. carchariae chitinase A. The topology of the secondary structure was predicted to be similar to the structure of SmChiA. Overall, the structure contained three domains: an N-terminal chitin binding domain connected with a small hinge region, a (?/?)8 TIM barrel catalytic domain and a small insertion domain. My previous results showed that the full-length chitinase A gene encoded 850 amino acids, giving an expressed chitinase A Precursor of Mr 95,000. MALDI-TOF MS revealed the Mr of the native enzyme to be 62,698, suggesting the C-terminal proteolytic cleavage site to be located between Arg597-Lys598. As a result, it allowed the DNA fragment that encodes the mature chitinase A to be generated in vitro and subsequently cloned into a QlAexpress expression system and E. coli M15. The expressed 63-kDa protein, containing six histidine residues tagged at the C-terminus, exhibited chitinase activity on a gel activity assay. As revealed by HPLC-MS, the expressed proteins showed indentical characteristics in chitin hydrolysis with the native enzyme. Crystallisation trials showed that the recombinant chitinase A could form crystals under a crystallisation buffer containing 0.1 M sodium acetate buffer, pH 4.6 containing 10% PEG 400 and 0.125 M CaCl2 as precipitant and at 15? C. Preliminary structural analysis revealed that the crystal diffracted X-rays up to 2.14 ? resolution with 97.2% completeness and belonged to the tetragonal space group P4122, or P4322 with unit-cell parameters a = 127.64, b = 127.64, c = 171.42 ?.

บรรณานุกรม :
วิภา สุจินต์ . (2549). การศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของเอ็นไซม์ไคติเนสที่สกัดจากเชื้อ Vibrio carchariae แต่แสดงออกใน E. coli: การนำผลิตผลจากการย่อยสลายไคตินโดยขบวนการชีวภาพมาใช้ประโยชน์ทางการแพทย์.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วิภา สุจินต์ . 2549. "การศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของเอ็นไซม์ไคติเนสที่สกัดจากเชื้อ Vibrio carchariae แต่แสดงออกใน E. coli: การนำผลิตผลจากการย่อยสลายไคตินโดยขบวนการชีวภาพมาใช้ประโยชน์ทางการแพทย์".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วิภา สุจินต์ . "การศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของเอ็นไซม์ไคติเนสที่สกัดจากเชื้อ Vibrio carchariae แต่แสดงออกใน E. coli: การนำผลิตผลจากการย่อยสลายไคตินโดยขบวนการชีวภาพมาใช้ประโยชน์ทางการแพทย์."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2549. Print.
วิภา สุจินต์ . การศึกษาโครงสร้างและหน้าที่ของเอ็นไซม์ไคติเนสที่สกัดจากเชื้อ Vibrio carchariae แต่แสดงออกใน E. coli: การนำผลิตผลจากการย่อยสลายไคตินโดยขบวนการชีวภาพมาใช้ประโยชน์ทางการแพทย์. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2549.