ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การวิเคราะห์เชิงอณูชีวฟิสิกส์ของการเกิดรูรั่วในผนังเนื้อเยื่อสังเคราะห์ที่เกิดขึ้นโดยชิ้นส่วนโปรตีนสารพิษจากเชื้อบาซิลลัส ทูริงไจเอนซิส

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การวิเคราะห์เชิงอณูชีวฟิสิกส์ของการเกิดรูรั่วในผนังเนื้อเยื่อสังเคราะห์ที่เกิดขึ้นโดยชิ้นส่วนโปรตีนสารพิษจากเชื้อบาซิลลัส ทูริงไจเอนซิส
นักวิจัย : ชนันท์ อังศุธนสมบัติ
คำค้น : Bacillus thuringiensis , Delta-endotoxins , Inclusion Solubility , larvicidal activity , Molecular Dynamics Simulations , Refolding , Site-directed mutagenesis
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2544
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RSA4080012 , http://research.trf.or.th/node/1570
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

กลไกการออกฤทธิ์ของโปรตีนสารพิษแต่ละชนิดจากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis (Bt) นั้น เชื่อว่าเกี่ยวข้องกับการเกิดรูรั่วที่ผนังเนื้อเยื่อเซลล์บุผิวกระเพาะอาหารส่วนกลางในตัว หนอนแมลงที่กินโปรตีนสารพิษนี้เข้าไป จากการศึกษาเบื้องต้นพบว่า โปรตีนสารพิษชนิด Cry4B ขนาด 130 กิโลดาลตัน ซึ่งเมื่อถูกกระตุ้นด้วยเอนไซม์ trypsin จะได้ชิ้นส่วนโปรตีนขนาด ประมาณ 47 และ 21 กิโลดาลตัน โดยที่ชิ้น 21 กิโลดาลตัน มีองค์ประกอบเป็นเกลียวอัลฟาที่ 1- 5 ซึ่งเชื่อว่าจะเป็นส่วนที่สอดแทรกเข้าไปในผนังเนื้อเยื่อทำให้เกิดรูรั่ว โครงการนี้มีวัตถุประสงค์ เพื่อการศึกษาหาข้อมูลพื้นฐานที่จะนำไปสู่ความเข้าใจมากยิ่งขึ้นเกี่ยวกับกลไกการสอดแทรก และการทำให้เกิดรูรั่วในผนังเนื้อเยื่อที่เกิดโดยโปรตีนสารพิษชนิด Cry4B ในรายงานนี้ เราได้ใช้เชื้อ E. coli ในการสร้างชิ้นส่วนโปรตีน PPF ซึ่งเป็นส่วนเกลียวอัล ฟาที่ 1-5 ดังกล่าวเป็นปริมาณมาก และอยู่ในรูปของผลึกโปรตีนที่ไม่ละลาย ซึ่งเมื่อนำมาแยก บริสุทธิ์เบื้องต้นพบว่า ผลึกโปรตีนดังกล่าวประกอบด้วยโปรตีนขนาด 23 กิโลดาลตัน และ สามารถจับตัวกับ Cry4B antibodies ได้อย่างจำเพาะเจาะจง และยังพบว่า ลำดับกรดอะมิโน ทางด้านปลายอะมิโนเหมือนกับของโปรตีนสารพิษ Cry4B ขนาด 130 กิโลดาลตัน อย่างไรก็ ตามผลึกโปรตีน PPF นี้จะสามารถละลายได้ในตัวทำละลายที่มี 6M urea โปรตีน PPF นี้ ดู เหมือนว่าอยู่ในรูป oligomer และคงทนต่อการตัดย่อยด้วยเอนไซม์ trypsin พร้อมกันนี้พบว่า โปรตีน PPF ที่ได้ทำให้เกิดการขดตัวใหม่นี้สามารถทำให้เกิดการรั่วไหลของ glucose ที่ถูกใส่ไว้ ใน liposomes จึงเสริมกับข้อสมมติฐานที่ว่า ชิ้นส่วน PPF ซึ่งประกอบด้วยเกลียวอัลฟาที่ 1-5 นั้น เป็นส่วนที่เกี่ยวข้องกับการทำให้เกิดรูรั่วของโปรตีนสารพิษดังกล่าว นอกจากนี้เราได้อาศัย วิธีการ single proline substitutions พบว่าการหักของเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 มีผลกระทบโดย ตรงกับความเป็นพิษฆ่าลูกน้ำยุง จึงเชื่อว่าเกลียวอัลฟาทั้ง 2 น่าจะเป็นองค์ประกอบที่สำคัญใน การทำให้เกิดรูรั่วบนผนังเนื้อเยื่อ และได้ใช้วิธีการ charged to alanine mutagenesis ไปเปลี่ยน กรดอะมิโนที่มีประจุหรือมีขั้วไปเป็น alanine ในเกลียวอัลฟาที่ 4 อันได้แก่ Arg-143 Lys-156 Arg-158 Glu-159 และ Asn-151 พบว่า Arg-158 มีความสำคัญต่อความเป็นพิษของโปรตีน สารพิษ ซึ่งเมื่อนำข้อมูลนี้ไปใช้ร่วมกับวิธีการ Molecular Dynamics Simulations พบว่า รูรั่ว จำลอง (pore model) ที่สร้างขึ้นในเนื้อเยื่อสังเคราะห์ที่มีน้ำร่วมอยู่ด้วยนั้น ซึ่งสร้างขึ้นจาก เกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 (กรดอะมิโน Gln-140 ถึง Glu-198) ประกอบกันเป็น hexamers นั้น โดยที่ตำแหน่ง Arg-158 อยู่ทางด้านรูรั่วพบว่า ค่าการนำไฟฟ้า (conductance) ที่คำนวณได้นั้น ให้ค่าขนาดของรูรั่วที่เกิดขึ้นมีส่วนเส้นผ่าศูนย์กลางประมาณ 2-3 นาโนเมตร The different Cry ?-endotoxins produced by Bacillus thuringiensis have been shown to kill susceptible insect larvae by forming a lytic pore in the target midgut epithelial cell membrane. In the previous studies, we have shown that tryptic activation of the 130-kDa Cry4B toxin produced protease-resistant products of ca. 47 kDa and ca. 21 kDa. The 21-kDa fragment was identified to be the N-terminal five-helix bundle (?1- ?5) which is a potential candidate for membrane insertion and pore formation. In this report, we have constructed the recombinant clone over-expressing the putative pore-forming (PPF) fragment (?1-?5) as inclusion bodies in Escherichia coli. The partially purified inclusions were composed of a 23-kDa protein which cross-reacted with Cry4B antibodies and whose N-terminus was identical to that of the 130-kDa protein. Dissimilar to protoxin inclusions, the PPF inclusions were only soluble when the carbonate buffer, pH 9.0 was supplemented with 6 M urea. After renaturation via stepwise dialysis, the refolded PPF protein appeared to exist as an oligomer and was structurally stable upon trypsin treatment. Unlike the 130-kDa protoxin, the refolded protein was able to release entrapped glucose from liposomes comparable to the activated toxin, although it lacks larvicidal activity against Aedes aegypti.. These results therefore support the notion that the PPF fragment consisting of ?1-?5 of the activated Cry4B toxin is involved in membrane pore-formation. We have also employed single proline substitutions via PCR-based mutagenesis and demonstrated that helices 4 and 5 in the pore-forming domain of the Cry4B toxin are essential for mosquito-larvicidal activity, likely to be involved in pore formation rather than in receptor binding. To further identify critical residues for toxicity, substitutions with alanine of each of the charged amino acids (Arg-143, Lys-156, Arg-158 and Glu- 159) and one polar residues (Asn-151) in the transmembrane helix 4 were performed. Similar to the wild-type Cry4B protoxin, all five mutant toxins were over-expressed as cytoplasmic inclusions in E. coli and were structurally stable upon solubilisation and trypsin activation in carbonate buffer, pH 9.0. Interestingly, a complete loss of activity against A. aegypti larvae was observed for the alanine substitution at Arg-158, while replacements at the four other positions did not affect the toxicity. The results reveal a crucial role in toxin function for the positively charged side chain of Arg-158 in helix 4 of the Cry4B toxin. The putative transmembrane segments, helices 4 and 5 were further studied by means of nanosecond molecular dynamics (MD) simulation. The ?4-?5 hairpin (residues Gln140-Glu198) was truncated from a 3D homology model of Cry4B and inserted into a fully hydrated lipid bilayer. It adopts a stable helical hairpin-liked structure of which the amphipathic ?4 was stabilised by favorable interactions between pockets of membrane-penetrating water molecules and side chains of polar residues while the relatively hydrophobic ?5 appeared to unwind at its C-terminus. Unrestrained MD simulations were performed with a model pore consisting of six copies of the ?4-? 5 hairpin in a fully hydrated lipid bilayer with Arg-158 pointing inward to pore lumen. Predicted conductance values suggested that the transmembrane ?4-?5 hairpin of Cry4B has a potential to form a stable oligemeric pore with 2-3 nm in diameter.

บรรณานุกรม :
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . (2544). การวิเคราะห์เชิงอณูชีวฟิสิกส์ของการเกิดรูรั่วในผนังเนื้อเยื่อสังเคราะห์ที่เกิดขึ้นโดยชิ้นส่วนโปรตีนสารพิษจากเชื้อบาซิลลัส ทูริงไจเอนซิส.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . 2544. "การวิเคราะห์เชิงอณูชีวฟิสิกส์ของการเกิดรูรั่วในผนังเนื้อเยื่อสังเคราะห์ที่เกิดขึ้นโดยชิ้นส่วนโปรตีนสารพิษจากเชื้อบาซิลลัส ทูริงไจเอนซิส".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . "การวิเคราะห์เชิงอณูชีวฟิสิกส์ของการเกิดรูรั่วในผนังเนื้อเยื่อสังเคราะห์ที่เกิดขึ้นโดยชิ้นส่วนโปรตีนสารพิษจากเชื้อบาซิลลัส ทูริงไจเอนซิส."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2544. Print.
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . การวิเคราะห์เชิงอณูชีวฟิสิกส์ของการเกิดรูรั่วในผนังเนื้อเยื่อสังเคราะห์ที่เกิดขึ้นโดยชิ้นส่วนโปรตีนสารพิษจากเชื้อบาซิลลัส ทูริงไจเอนซิส. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2544.