ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การศึกษาเอนไซม์และยินดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสในกระบวนการเกิดดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นในข้าวไทย

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การศึกษาเอนไซม์และยินดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสในกระบวนการเกิดดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นในข้าวไทย
นักวิจัย : จรัญญา ณรงคะชวนะ
คำค้น : -
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2542
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RSA3880004 , http://research.trf.or.th/node/1531
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

การศึกษากลไกการควบคุมการแสดงออกของยีนในพืชมีความจำเป็น และเป็นข้อมูลพื้น ฐานที่สำคัญในการนำมาประยุกต์ใช้เพื่อปรับปรุงคุณสมบัติต่างๆของพืชได้อย่างมีประสิทธิภาพ ดี เอ็นเอเมทิลเลชั่นเป็นกลไกที่สามารถควบคุมการแสดงออกของยีนในขั้นตอนเริ่มต้น และมีรายงาน ว่ามีผลกระทบอย่างมากต่อการกดดันการแสดงออกของยีนและความเสถียรของยีนในสิ่งมีชีวิตที่ ผ่านกระบวนการถ่ายยีน แม้ดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นจะถูกพบในจีโนมของพืชทุกชนิด แต่ข้อมูลการ ศึกษาบทบาทของดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นในพืชยังมีอยู่น้อยมาก เมื่อเปรียบเทียบกับสิ่งมีชีวิตชนิดอื่น สำหรับโครงการวิจัยนี้ผู้วิจัยมีวัตถุประสงค์ที่จะมุ่งเน้นการศึกษาข้อมูลเกี่ยวกับกระบวนการเกิดดี เอ็นเอเมทิลเลชั่นในข้าวไทย (Oryza sativa spp. Indica) โดยจะทำการสกัดและแยกเอนไซม์ดีเอ็น เอเมทิลทรานสเฟอเรส (DNA MTase) ให้บริสุทธิ์ เพื่อนำมาศึกษาชนิดและคุณสมบัติจำเพาะต่างๆ ของเอนไซม์ และจะทำการแยกยีน DNA MTase ดังกล่าวมาวิเคราะห์ลำดับเบส และศึกษาการ แสดงออก การดำเนินงานวิจัยของโครงการนี้ในช่วง 3 ปี (1 กันยายน 2538 - 31 สิงหาคม 2541) ผู้ วิจัยสามารถพัฒนาวิธีการเตรียมเอนไซม์ DNA MTase ที่มีความบริสุทธิ์สูง จาก nuclei extract ของยอดอ่อนต้นข้าว rice DNA MTase บริสุทธิ์ที่แยกได้มีขนาดประมาณ 130 kDa (native) และ 55 kDa (ใน SDS-PAGE) เป็น maintenance cytosine DNA MTase ซึ่งมีความจำเพาะกับ hemi- methylated DNA substrate สามารถ methylate DNA substrate ใน in vitro ได้ดีขึ้นกว่าใน in vivo โดย eukaryotic DNA methylation inhibitor และ de-methylating agent สามารถ inhibit activity ของ rice DNA MTase ได้ rice DNA MTase ไม่ต้องการ co-factor ใดๆ มี optimal pH ในช่วง 7.6 - 8.0 และ optimal temperture ที่ 25?C เอนไซม์นี้ไม่ stable และไม่มี demethylating activity มีค่า Km ต่อ rice DNA substrate = 50 ?g/ml, Km ต่อ synthetic hemi-methylated DNA substrate=16.67 ?g/ml และ Km ต่อ S-adenosylmethionine (methyl donor) = 2.63 ?M ผู้วิจัยสามารถ clone cDNA ของ rice DNA MTase จาก cDNA library ที่เตรียมได้ โดย พบ insert ที่มีขนาดประมาณ 4.7 kbp ตั้งชื่อว่า pRM1 (rice DNA MTase clone #1) เมื่อทำการวิเคราะห์ลำดับเบสของ putative cloned cDNA ของ rice DNA MTase ใน pRM1 พบ ว่า total nucleotide sequence ที่ clone ได้ คือ 4,712 nucleotides โดย open reading frame (translation region) เป็น 4,506 nucleotides และ inferred amino acid sequence 1,502 amino acids ผลการวิเคราะห์ functional domains ของ rice DNA MTase inferred amino acid sequence เมื่อเปรียบเทียบกับ known sequence พบว่ามี linker และ conserved motif ต่างๆ ของ DNA MTase เช่น SAM binding site และ Active site ในบริเวณ C-terminal region เมื่อทำ alignment ส่วน conserved motifs ของ rice DNA MTase amino acid sequence เปรียบเทียบกับ known sequence ของพืชอื่น พบว่าส่วน conserved motifs ของ DNA MTase ของข้าว ข้าวโพด แครอท มะเขือเทศ ถั่ว และ Arabidopsis มี identity สูง ผลการทำ Southern blot hybridization ชี้ ให้เห็นว่ายีน DNA MTase ใน genome ของข้าว อาจมีเพียง copy เดียว จากการศึกษาการแสดง ออกของยีน DNA MTase ในขั้นตอนต่างๆระหว่างการพัฒนาของต้นข้าว โดย Northern blot hybridization พบว่าไม่มีการแสดงออกของยีนนี้ใน dry embryo แต่เมื่อเมล็ดข้าวถูกแช่น้ำเริ่มการ germination จะมีการแสดงออกของ DMA MTase เพิ่มขึ้น จนกระทั่งสูงสุดที่ seedling อายุ 10 วัน แล้วมีการแสดงออกที่ค่อนข้างคงที่ จนถึง mature plant นอกจากนั้นในรากพบการแสดงออกของ ยีน DNA MTase น้อยกว่าในใบข้าวซึ่งเมื่อพิจารณาประกอบกับข้อมูลระดับ methylated cytosine ใน genome และ DNA MTase enzyme activity ที่ได้ศึกษาในเบื้องต้นแล้ว ผลการทดลองนับว่า สอดคล้องกัน คาดว่าข้อมูลพื้นฐานต่างๆเหล่านี้จะเป็นประโยชน์ทำให้สามารถเข้าใจกลไกการควบคุมและ การทำงานของเอนไซม์ DNA MTase ตลอดขบวนการ development ในระยะต่างๆ ของพืชได้มาก และดียิ่งขึ้น เอนไซม์และยีน DNA MTase ที่แยกได้ จะมีประโยชน์ในการศึกษาบทบาทของดีเอ็นเอ เมทิลเลชั่นในพืชได้อย่างลึกซึ้งขึ้น Studies of mechanisms governing differential gene expression in specific organs and at appropriate growth stages are necessary for potential improvement of plant properties. DNA methylation is a specific structural modification of DNA molecules which can effect gene expression and has been suggested to affect the stability of transgene in genetic transformation processes. Generally, the plant genome is extensively methylated. However, our understanding of DNA methylation in plants has remained primitive and be a conspicuous black box in plant molecular biology. We have attempted to investigated on the role and regulation of DNA methylation in plants by focusing on rice, which is an economically improtant plant of Thailand. In spite of the possible important of DNA methylation in plants, the enzyme involving in these modification of DNA have been recieved little attention. The ultimate goal of this research project is to purify and characterize the DNA methyltransferase (DNA MTase) enzyme. The further study is to clone, sequence and characterize the regulation of expression of this gene. Rice DNA MTase appeared to be located entirely within the nuclear fractions. Nuclear DNA MTase was prepared from nuclei by salt extraction and subsequently purified by three different chromatography. The purified rice DNA MTase contained relatively high specific activity. The native enzyme was approximately 130 kDa and showed 55 kDa in SDS-PAGE. Sequence specificity of methylation had been investigated in vitro using purified enzyme with various substrates. Others properties of rice DNA MTase were studied and discussed. A cDNA encoding DNA MTase of rice had been cloned and sequenced. The nucleotide sequence contained an open reading frame of 4,506 nucleotides sufficient to encode a polypeptide of 1502 amino acid residues, which was close to the apparent size of DNA MTase found in rice extract. Like the other eukaryotic DNA MTase, the inferred protein had a presumed regulatory N-terminal region linked to a catalytic C-terminal domain, which had ten conserved motifs found in prokaryotic DNA MTase. Southern blot analysis of rice genomic DNA indicated the presence of a single gene. Using Northern blot analysis of total RNA from different developmental stages and different tissues, we had observed that expression is confined mostly to the rapidly dividing tissues of the plant. Since DNA methylation may involve in developmental stages of plants, the investigation of the role and regulation of DNA methylation in relation to plant embryogenesis and somaclonal variation is of interest for plant regeneration aspects. Furthermore, the expression and stability of transgene in transgenic plant has been postulated to be interfered by DNA methylation. Thus, overall studies on mechanisms that regulate plant DNA methylation is expected to provide an important basic knowledge for understanding plant development as well as for potential improvement of plant and transgenic plant processes.

บรรณานุกรม :
จรัญญา ณรงคะชวนะ . (2542). การศึกษาเอนไซม์และยินดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสในกระบวนการเกิดดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นในข้าวไทย.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
จรัญญา ณรงคะชวนะ . 2542. "การศึกษาเอนไซม์และยินดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสในกระบวนการเกิดดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นในข้าวไทย".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
จรัญญา ณรงคะชวนะ . "การศึกษาเอนไซม์และยินดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสในกระบวนการเกิดดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นในข้าวไทย."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2542. Print.
จรัญญา ณรงคะชวนะ . การศึกษาเอนไซม์และยินดีเอ็นเอเมทิลทรานสเฟอเรสในกระบวนการเกิดดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นในข้าวไทย. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2542.