ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การผลิตโมโนโคนนอลแอนติบอดี ต่อ CD4 และ CD8 โปรตีน และการพัฒนาวิธีการตรวจเพื่อช่วยพยากรณ์ความรุนแรงของโรคและใช้เป็นแนวทางการรักษาผู้ติดเชื้อเอดส์

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การผลิตโมโนโคนนอลแอนติบอดี ต่อ CD4 และ CD8 โปรตีน และการพัฒนาวิธีการตรวจเพื่อช่วยพยากรณ์ความรุนแรงของโรคและใช้เป็นแนวทางการรักษาผู้ติดเชื้อเอดส์
นักวิจัย : วัชระ กสิณฤกษ์
คำค้น : -
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2541
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RSA3780023 , http://research.trf.or.th/node/1519
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

โครงการวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อผลิตแอนติบอดี ต่อ CD4 และ CD8 โปรตีน แล้วนำ แอนติบอดีที่ผลิตได้มาพัฒนาเป็นวิธีและนำ้ยาเพื่อตรวจนับจำนวน CD4+ cells จากการศึกษาใน 3 ปี (ธันวาคม 2537-พฤศจิกายน 2540) ผู้วิจัยได้ทำการศึกษาโดยมีราย ละเอียดและผลการศึกษาดังนี้คือ 1. ผู้วิจัยสามารถแยก hybridomas ที่ผลิตโมโนโคลนอล แอนติบอดี ต่อ CD4 และ CD8 proteins ได้อย่างละ 1 โคลน ให้ชื่อว่า MT4 และ MT8 ตามลำดับ จากการศึกษาความจำเพาะของโมโนโคล นอล แอนติบอดี ที่ผลิตได้ พบว่า MT4 และ MT8 monoclonal antibody (mAb) สามารถทำ ปฏิกิริยาได้กับทั้ง native และ recombinant CD4 และ CD8 proteins ตามลำดับ MT4 และ MT8 mAb สามารถ inhibit ปฏิกิริยาของ standard CD4 (Leu3a) และ CD8 (Leu2) mAb ได้ และ สามารถนำไปใช้ตรวจนับจำนวน CD4+ และ CD8+ cells ใน peripheral blood ได้เท่าๆ กับ การ ใช้ standard CD4 และ CD8 mAb ผลการศึกษายืนยันได้ว่า MT4 และ MT8 mAb ทำปฏิกิริยา จำเพาะกับ CD4 และ CD8 proteins ตามลำดับ 2. ผู้วิจัยได้นำวิธี DNA immunization มาประยุกต์ใช้ในการผลิตแอนติบอดีต่อ CD4 proteins ใน หนูและในกระต่าย โดยพบว่าวิธี DNA immunization นี้สามารถกระตุ้นให้สัตว์ทดลองสร้าง แอนติบอดีต่อ CD4 proteins ได้หลังการฉีด cDNA encoding CD4 protein (CD4-DNA) 1-3 ครั้ง จากการศึกษาในหนู พบว่า 4 ใน 5 ของหนูที่ฉีด CD4-DNA สร้าง anti-CD4 antibodies ขณะที่ 3 ใน 3 ของกระต่ายสร้าง anti-CD4 antibodies จากการศึกษาความจำเพาะของ CD4 polyclonal antibodies ที่ผลิตได้ พบว่าแอนติบอดีที่ผลิตได้นี้ทำปฎิกิริยาจำเพาะได้กับทั้ง CD4 proteins 3. ผู้วิจัยได้พัฒนาวิธี Manual rosetting ขึ้นมาเพื่อตรวจนับจำนวน CD4+ cells และเมื่อนำวิธีที่ พัฒนาขึ้นมานี้มาตรวจนับจำนวน CD4+ cells ในเลือดผู้ป่วยเอดส์และคนปกติจำนวน 40 คน เปรียบเทียบกับวิธีมาตรฐาน flow cytometry ผลการทดลองพบว่าวิธีทั้งสองให้ผลไม่แตกต่างกัน โดยมีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เท่ากับ 0.95 แต่เมื่อผู้วิจัยพัฒนาวิธี Manual rosetting ให้มีวิธีการ ทำที่ง่ายยิ่งขึ้น โดยการนำ MT4 monoclonal antibody ไปเคลือบบนเม็ดเลือดแดงแกะ และ tosyl- activated beads โดยตรง แล้วนำมาตรวจนับจำนวน CD4+ cells ในเลือดโดยวิธี Direct manual rosetting ผลการทดลองพบว่าจำนวน CD4+ cells ที่ได้โดยวิธี Direct manual rosetting นี้ให้ค่าตำ่ กว่าวิธีมาตรฐาน flow cytometry อย่างมีนัยสำคัญ 4. ผู้วิจัยได้นำ MT4 mAb และแอนติบอดีต่อ CD4 โปรตีนที่ผลิตจากวิธี DNA immunization มา พัฒนาเป็นวิธี Sandwich ELISA เพื่อใช้ตรวจหา soluble CD4 proteins และเมื่อนำวิธีที่พัฒนาขึ้น มานี้มาหาปริมาณ soluble CD4 proteins ในเลือดผู้ติดเชื้อ HIV จำนวน 59 คน และคนปกติจำนวน 56 คน ผลการทดลองพบว่า ปริมาณ soluble CD4 proteins ในเลือดไม่มีความสัมพันธ์กับจำนวน absolute CD4+ cells โดยมีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เท่ากับ 0.187 และเมื่อเปรียบเทียบปริมาณ soluble CD4 proteins ในเลือดผู้ติดเชื้อ HIV กับคนปกติ พบว่าค่าที่ได้จากกลุ่มตัวอย่างทั้งสองไม่ แตกต่างกัน 5. ผู้วิจัยได้นำ MT4 mAb มาผลิตเป็นน้ำยาตรวจนับจำนวน CD4+ cells เพื่อใช้กับเครื่อง flow cytometer ขึ้นมาใช้เอง โดยนำ purified MT4 mAb มาติดฉลากกับสาร fluorescein isothiocyanate (FITC) แล้วนำไปใช้ตรวจนับจำนวน CD4+ cells โดยวิธี flow cytometry และเมื่อ นำ FITC labeled MT4 มาตรวจนับจำนวน CD4+ cells ในเลือดผู้ติดเชื้อเอดส์และคนปกติจำนวน อย่างละ 60 ราย เปรียบเทียบกับชุดน้ำยามาตรฐาน SimultestTM ของบริษัท Becton Dickinson ผล การศึกษาพบว่าเปอร์เซนต์และค่า absolute CD4+ cell counts ที่ได้จากน้ำยาทั้งสองชนิดใกล้เคียง กันมาก โดยมีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ เท่ากับ 0.995 และ 0.996 สำหรับเปอร์เซนต์และค่า absolute CD4+ lymphocyte counts ตามลำดับ ผลการศึกษาในครั้งนี้ชี้ให้เห็นว่า น้ำยา FITC labeled MT4 ที่เตรียมขึ้นมาใช้เองนี้น่าจะเป็นน้ำยาอีกชนิดหนึ่งที่สามารถนำมาใช้ตรวจวัดระดับ CD4+ cells ในเลือดโดยวิธี flow cytometry ได้ The aims of this research are to generate antibodies against CD4 and CD8 proteins and use the generated antibodies to develop methods and reagents for CD4+ cell determination. On completion of 3 years’ work (December 1994-November 1997), the out puts from this study are as follows: 1. Two hybridomas that produced antibodies against CD4 and CD8 proteins, named MT4 and MT8 respectively, were generated. MT4 and MT8 monoclonal antibodies (mAb) were proved to be specific to CD4 and CD8 proteins as they reacted to native and recombinant CD4 and CD8, respectively. The MT4 and MT8 mAb could inhibit the reactivity of standard CD4 (Leu3a) and CD8 (Leu2) mAb. Furthermore, they could be used to enumerate CD4+ and CD8+ cells in blood samples as well as using standard CD4 and CD8 mAb. These results, therefore, demonstrate that generated MT4 and MT8 mAb are specific to CD4 and CD8 proteins, respectively. 2. DNA immunization was also used to produce polyclonal antibodies to CD4 proteins in mice and rabbits. By using this technique, anti-CD4 antibodies were induced in tested animals after 1-3 inoculations of cDNA encoding CD4 protein (CD4-DNA). In the mouse system, 4 out of 5 mice produced anti-CD4 antibodies after CD4-DNA immunization. In rabbits, 3 of 3 rabbits produced anti-CD4 antibodies after DNA immunization. These antibodies reacted with either native or recombinant CD4 molecules. 3. The manual rosetting method was developed for enumerating CD4+ cells. To evaluate this method, CD4+ cells in normal and HIV infected individuals were determined by using both manual rosetting and standard flow cytometry, simultaneously. The absolute CD4+ cell counts obtained from both methods were very similar with the correlation coefficient of 0.95. The manual rosetting technique was developed further for a simple procedure. MT4 mAb was directly coated on sheep red blood cells or tosyl-activated beads. These coated particles were then used to enumerated CD4+ cells in blood samples by direct manual rosetting technique. The CD4+ cell counts obtained from this direct manual rosetting, however, was significantly lower than those obtained by using standard flow cytometry. 4. Sandwich ELISA for quantifying soluble CD4 proteins was established by using generated MT4 mAb and rabbit anti-CD4 antibodies, which were obtained from DNA immunization. The sandwich ELISA was used to determine soluble CD4 proteins in blood of 59 HIV infected and 56 healthy individuals. The study has shown that the levels of soluble CD4 proteins in tested blood were not correlated to the absolute number of CD4+ cells with the correlation coefficient of 0.187. When the levels of soluble CD4 proteins in HIV infected and healthy individuals were compared, no significant difference in soluble CD4 levels in both studied groups was observed. 5. To develop a home made reagent for CD4+ cell determination by flow cytometry, fluorescein isothiocyanate (FITC) was conjugated to affinity purified MT4 mAb. To evaluate this developed reagent, 30 HIV infected and 30 healthy individuals were determined for CD4+ cells by using both the commercial Simultest reagent kit (Becton Dickinson) and the home made FITC labeled MT4 mAb, simultaneously. The study has shown that both percentages and absolute CD4+ cell counts obtained from both reagents were equivalent. The correlation coefficient for regression analysis were 0.995 and 0.996 for percentages and absolute CD4+ cell counts, respectively. The results suggest that the home made FITC labeled MT4 mAb reagent is an acceptable alternative reagent for monitoring CD4+ cells in blood samples by flow cytometry.

บรรณานุกรม :
วัชระ กสิณฤกษ์ . (2541). การผลิตโมโนโคนนอลแอนติบอดี ต่อ CD4 และ CD8 โปรตีน และการพัฒนาวิธีการตรวจเพื่อช่วยพยากรณ์ความรุนแรงของโรคและใช้เป็นแนวทางการรักษาผู้ติดเชื้อเอดส์.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วัชระ กสิณฤกษ์ . 2541. "การผลิตโมโนโคนนอลแอนติบอดี ต่อ CD4 และ CD8 โปรตีน และการพัฒนาวิธีการตรวจเพื่อช่วยพยากรณ์ความรุนแรงของโรคและใช้เป็นแนวทางการรักษาผู้ติดเชื้อเอดส์".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วัชระ กสิณฤกษ์ . "การผลิตโมโนโคนนอลแอนติบอดี ต่อ CD4 และ CD8 โปรตีน และการพัฒนาวิธีการตรวจเพื่อช่วยพยากรณ์ความรุนแรงของโรคและใช้เป็นแนวทางการรักษาผู้ติดเชื้อเอดส์."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2541. Print.
วัชระ กสิณฤกษ์ . การผลิตโมโนโคนนอลแอนติบอดี ต่อ CD4 และ CD8 โปรตีน และการพัฒนาวิธีการตรวจเพื่อช่วยพยากรณ์ความรุนแรงของโรคและใช้เป็นแนวทางการรักษาผู้ติดเชื้อเอดส์. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2541.