ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การโคลนและแสดงออกของเอ็นไซม์ไดไฮโดรโฟเลตรีดัคเทสจากเชื้อ Mycobacteria

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การโคลนและแสดงออกของเอ็นไซม์ไดไฮโดรโฟเลตรีดัคเทสจากเชื้อ Mycobacteria
นักวิจัย : วรชาติ สิรวราภรณ์
คำค้น : -
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2541
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RSA3780004 , http://research.trf.or.th/node/1506
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเทส (dihydrofolate reductase, DHFR) เป็นเป้าสำคัญในเชิงเคมีบำบัด (chemotherapy) เอ็นไซม์ DHFR ทำหน้าที่ในการรีดิวส์ H2folate ให้เป็น H4folate ในขบวนการ สังเคราะห์โฟเลตโดยอาศัย NADPH เป็นโคแฟคเตอร์ ในงานวิจัยนี้ คณะผู้วิจัยจะได้ทำการศึกษาเอ็น ไซม์ DHFR จากเชื้อ Mycobacterium turberculosis และ Mycobacterium leprae ซึ่งเป็นสาเหตุของ วัณโรคและโรคเรื้อนตามลำดับ ผลการวิจัยนี้อาจนำไปสู่การออกแบบตลอดจนการพัฒนายา antifolates ใหม่ๆ ซึ่งมีประสิทธิภาพต่อเชื้อที่ดื้อยาได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งวัณโรคซึ่งมีแนวโน้มที่จะ สร้างปัญหามากขึ้นจากผลกระทบของการแพร่ระบาดของเชื้อเอดส์ที่เพิ่มขึ้นในประเทศไทย จากการใช้ชิ้นส่วนยีนไทมิไดเลต ซินเทส ( thymidylate synthase, TS) จากเชื้อ BCG เป็นตัว ตรวจสอบ (probe) คณะผู้วิจัยได้ประสบความสำเร็จในการ screen หาโคลนที่มีชิ้นของยีน DHFR จาก gDNA libraries ของ M leprae และ M.tuberculosis เมื่อทำการวิเคราะห์หาลำดับเบสของโคลน ที่ได้พบว่า DHFR ของ M.leprae มีความยาว 498 คู่ สามารถให้กรดอะมิโน 165 ตัว และ DHFR ของ M.tuberculosis มีความยาว 480 คู่ แปลให้กรดอะมิโน 159 ตัว ผลการวิเคราะห์พบว่าลำดับกรดอะมิ โนของ DHFR จากเชื้อทั้งสองมีความคล้ายคลึงกันมาก DHFR ของ M.leprae มีน้ำหนักมวล 18 กิโลดาลตันโดยประมาณ และแสดงออกใน E.coli ในลักษณะเป็น inclusion bodies เมื่อเหนี่ยวนำด้วย IPTG ความเข้มข้น 0.4 mM ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 ชั่วโมง อย่างไรก็ตามผู้วิจัยไม่สามารถทำการแสดงออก DHFR ของ M.tuberculosis ภายใต้สภาวะเดียวกัน ผู้วิจัยได้ปรับเปลี่ยนสภาวะการแสดงออก และพบว่าหากลด อุณหภูมิลงถึง 20 องศาเซียลเซียส และเพิ่มเวลาเหนี่ยวนำเป็น 10-12 ชั่วโมง DHFR ของ M.leprae จะสามารถแสดงออกในรูปของ soluble enzyme ที่สามารถเร่งปฏิกิริยาได้ เมื่อทำการแยกเอ็นไซม์ ให้บริสุทธิ์ด้วย affinity chromatography โดยใช้ MTX-Sepharose และนำเอ็นไซม์ที่บริสุทธิ์นี้มา ศึกษาคุณสมบัติทางจลศาสตร์ ตลอดจนการถูกยับยั้งด้วยสาร antifolates พบว่า DHFR ของเชื้อ M.leprae มีค่า Km ต่อสัปสเตรท H2folate และโคแฟคเตอร์ NADPH เท่ากับ 5.6 uM และ 9.2 uM ตาม ลำดับเอ็นไซม์ DHFR ของ M.leprae ถูกยับยั้งด้วย trimethoprim ได้ดีที่สุดมีค่า Ki 0.07 uM และถูก ยับยั้งด้วย pyrimethamine และ cycloguanil ด้วย Ki 0.3 uM และ 78 uM ตามลำดับ ขณะรายงาน คณะผู้วิจัยยังอยู่ในระหว่างการปรับปรุงการแสดงออกเอ็นไซม์ DHFR ของ M.tuberculosis Dihydrofolate reductase (DHFR) is an importan target for chemotherapy. The enzyme catalyzes the NADPH-dependent reduction of H2folate to H4folate. In the present report, we describe our attempts to clone, express, and characterize DHFR from Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae, the causative agents of tuberculosis and leprosy, respectively. The results from this study might have implication for rational design of novel antifolates effective against multidrug-resistant Mycobacteria which has recently become increasingly wildspread due to the emergence of HIV-infection cases in Thailand. We have successfully exploited the highly conserved sequence of thymidylate synthase (TS) as a probe to screen for clones containing the DHFR gene from the genomic DNA libraries of M. leprae and M. tuberculosis. Sequence analysis of the clones showed that the DHFRs from M. leprae and M. tuberculosis were 498 and 480 bp, respectively. Both genes gave open reading frame with no intron. The deduced DHFRs from M. leprae and M. tuberculosis composed of 165 and 159 amino acids, respectively. The genes coding for both M. leprae and M. tuberculosis DHFR were cloned into pET-17b vector for heterologous expression in E. coli. Initial experiments using 0.4 mM IPTG to induce the expression of M. leprae DHFR at 37?C for 3 hr resulted in inactive inclusion bodies, but failed to express M. tuberculosis DHFR. Subsequent optimization of M. leprae DHFR expression (decrease the temperature to 20?C and prolong the induction time to 10-12 h) yielded active soluble enzyme which showed molecular mass of approximately 18 kDa upon SDS-PAGE. The DHFR from M. leprae was affinity purified using MTX-Sepharose. The Km values for substrate H2folate and NADPH were 5.6 and 9.2 ?M, respectively. Trimethoprim inhibited the enzyme with Ki ?0.07 ?M, while pyrimethamine and cycloguanil were about 4- and 1,000-fold less effective; the Ki values for pyrimethamine and cycloguanil were 0.3 ?M and 78 , respectively. Expression of M. tuberculosis DHFR is currently underway.

บรรณานุกรม :
วรชาติ สิรวราภรณ์ . (2541). การโคลนและแสดงออกของเอ็นไซม์ไดไฮโดรโฟเลตรีดัคเทสจากเชื้อ Mycobacteria.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วรชาติ สิรวราภรณ์ . 2541. "การโคลนและแสดงออกของเอ็นไซม์ไดไฮโดรโฟเลตรีดัคเทสจากเชื้อ Mycobacteria".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
วรชาติ สิรวราภรณ์ . "การโคลนและแสดงออกของเอ็นไซม์ไดไฮโดรโฟเลตรีดัคเทสจากเชื้อ Mycobacteria."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2541. Print.
วรชาติ สิรวราภรณ์ . การโคลนและแสดงออกของเอ็นไซม์ไดไฮโดรโฟเลตรีดัคเทสจากเชื้อ Mycobacteria. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2541.