ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

กลไกการสอดแทรกและการทำให้เกิดรูรั่วที่ระดับโมเลกุลของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงของเชื้อแบซิลลัสทูริงจิเอนซิส

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : กลไกการสอดแทรกและการทำให้เกิดรูรั่วที่ระดับโมเลกุลของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงของเชื้อแบซิลลัสทูริงจิเอนซิส
นักวิจัย : ชนันท์ อังศุธนสมบัติ
คำค้น : -
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2541
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RSA3780001 , http://research.trf.or.th/node/1503
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

โครงการนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาหาข้อมูลพื้นฐานของกลไกการออกฤทธิ์ที่ระดับโมเลกุล ของโปรตีนสารพิษฆ่าลูกน้ำยุง (mosquito-larvicidal ?-endotoxin) ของเชื้อ Bacillus thuringiensis โดยจะเน้นศึกษาถึงกลไกการสอดแทรกและการทำให้เกิดรูรั่ว (membrane insertion & pore formation) การศึกษาขั้นต้นได้แยกบริสุทธิ์โปรตีนสารพิษฆ่าลูกน้ำยุงชนิด Cry4B เฉพาะส่วนที่คาด ว่ารับผิดชอบในการทำให้เกิดรูรั่ว (putative pore-forming fragment, PPF) ซึ่งประกอบด้วยส่วนที่ เป็นเกลียวอัลฟา ทั้ง 7 ของ domain I และอีกบางส่วนของ domain II โดยได้ทำการ subclone ชิ้น PCR ของยีนเฉพาะส่วนที่สร้างโปรตีนดังกล่าวจากโปรตีนCry4B และนำมาแสดงออก ในเชื้อ Escherichia coli ภายใต้การควบคุมของยีนส่งเสริม tac promoter ผลปรากฎว่าเชื้อ E.coli สามารถถูกกระตุ้นให้สร้างโปรตีนดังกล่าวเป็นปริมาณสูงในรูปของผลึก เมื่อนำผลึกโปรตีนมาแยก บริสุทธิ์ด้วยวิธี sucrose density gradient centrifugation และวิเคราะห์ด้วยวิธี SDS-PAGE และ immunoblotting พบว่าผลึกโปรตีน PPF ประกอบด้วยโปรตีนขนาด 35 กิโลดาลตัน ซึ่งใกล้เคียง กับที่ได้ทำนายไว้ และแสดงปฏิกิริยาจับอย่างจำเพาะกับ Cry4B antiserum นอกจากนี้ผลจากการ ศึกษาการละลายพบว่าโปรตีน PPF ไม่ละลายในสารละลาย carbonate/DTT pH 10.5 ซึ่งปกติ สามารถละลายโปรตีนสารพิษ Cry4B ได้ดี อย่างไรก็ตามโปรตีน PPF ละลายได้ในสารละลายข้าง ต้นที่เสริมด้วย 8M urea ซึ่งเมื่อนำมาแยกบริสุทธิ์ยิ่งขึ้นด้วย size exclusion FPLC พบว่าโปรตีน PPF อยู่ในรูปของสารโมเลกุลขนาดใหญ่ (>300 kDa) เมื่อศึกษาคุณสมบัติการทำให้เกิดรูรั่วของ โปรตีน PPF ด้วยวิธี liposome-entrapped marker release พบว่าโปรตีนที่แยกบริสุทธิ์ได้ดังกล่าว สามารถทำให้เกิดการรั่วไหลของ glucose ที่ถูกใส่ไว้ใน liposomes ในขณะที่โปรตีนสารพิษ Cry4B เต็มขนาด ไม่สามารถทำให้เกิดรูรั่วดังกล่าวได้ อย่างไรก็ตาม โปรตีน PPF ไม่ทนทานต่อการตัด ย่อยของ trypsin ซึ่งเป็นการบ่งชี้ว่าโครงรูป (conformation) ของโปรตีนที่แยกได้นั้นอาจสูญเสีย สภาพธรรมชาติ (native form) ไป แต่เมื่อโปรตีน PPF ถูกเชื่อมต่อกับ biotinylated tag ซึ่งเป็น ส่วนของโปรตีนที่ใช้จับกับ avidin resin และสามารถถูกตัดออกได้ภายหลัง ทำให้สามารถแยก บริสุทธิ์โปรตีน PPF ที่อยู่ในรูปที่ละลายได้ (soluble form) และเมื่อตัดย่อยด้วย trypsin ปรากฎว่า ได้ชิ้นโปรตีนที่ต้านทานต่อการตัดย่อยซึ่งมีขนาดประมาณ 18 กิโลดาลตัน โดยมีขนาดและลำดับ กรดอะมิโนทางด้านปลาย N-terminus เหมือนกันกับหนึ่งในชิ้นย่อยของโปรตีนสารพิษ Cry4B ที่ถูก ตัดย่อยด้วย trypsin ซึ่งคาดว่าเป็นส่วนที่ประกอบด้วยเกลียวอัลฟา 1 ถึง 5 (?1-?5) และเชื่อว่าเป็น ส่วนที่รับผิดชอบในการสอดแทรกและการทำให้เกิดรูรั่วของโปรตีนสารพิษฆ่าลูกน้ำยุงดังกล่าว นอก จากนี้เมื่อได้เปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนของเกลียวอัลฟา 3 และ 4 เพื่อศึกษาผลกระทบต่อความเป็น พิษของโปรตีนสารพิษ Cry4B โดยได้เปลี่ยนให้เป็น proline เพื่อที่จะไปหักหรือทำลายลักษณะ ความเป็นเกลียวของเกลียวอัลฟาทั้ง 2 ตามลำดับ ผลปรากฎว่าเชื้อ E. coli ที่สร้างโปรตีนกลาย พันธุ์ V119P (เปลี่ยน valine ตำแหน่ง 119 ซึ่งเป็นตำแหน่งตรงกลางในเกลียวอัลฟา 3) และโปรตีน กลายพันธุ์ Q140P (เปลี่ยน glutamine ตำแหน่ง 140 ซึ่งอยู่ด้านปลาย N-terminus ของเกลียวอัล ฟา 4) นั้นมีฤทธิ์การฆ่าลูกน้ำยุงลายใกล้เคียงกับ wild type ซึ่งพอจะบ่งชี้ว่าการหักของเกลียวอัลฟา 3 ไม่มีผลกระทบต่อความเป็นพิษ อย่างไรก็ตามพบว่าเชื้อ E. coli ที่สร้างโปรตีนกลายพันธุ์ Q149P (เปลี่ยน glutamine ตำแหน่ง 149 ซึ่งเป็นตำแหน่งตรงกลางในเกลียวอัลฟา 4) นั้น ไม่สามารถออก ฤทธิ์ฆ่าลูกน้ำยุงลายได้ ทั้งๆ ที่มีระดับการสร้างโปรตีนที่ใกล้เคียงกับของ wild type และคุณสมบัติ การถูกละลายยังคงดีเหมือนเดิม นอกจากนี้พบว่าโปรตีนกลายพันธุ์ Q149P สามารถลดความเป็น พิษของเชื้อที่สร้างโปรตีน wild type ได้อย่างชัดเจน ซึ่งบ่งชี้ว่าการเปลี่ยนแปลงดังกล่าวที่เกลียวอัล ฟา 4 นี้ ไม่มีผลกระทบต่อส่วนที่ใช้ในการจับ จึงทำให้โปรตีนกลายพันธุ์ Q149P ยังคงสามารถแข่ง ขันไปจับกับ specific receptors บนผนังเนื้อเยื่อของกระเพาะลูกน้ำยุงได้ จึงพอจะสรุปได้ว่าเกลียว อัลฟา 4 มีบทบาทที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับความเป็นพิษ กล่าวคือ อาจเป็นองค์ประกอบที่สำคัญใน การทำให้เกิดรูรั่ว แต่ไม่เป็นส่วนที่สำคัญในการใช้ specific receptor โดยจะได้ศึกษาในรายละเอียด ต่อไป This project aims to provide a molecular description of membrane-inserting and pore-forming mechanisms of Bacillus thuringiensis ?-endotoxins. An attempt was made to express separately a putative pore-forming fragment (PPF) of the Cry4B mosquito-larvicidal toxin including the seven-helix bundle of domain I and some of the domain II. When the plasmid clone encoding the predicted PPF segment of the Cry4B toxin was expressed in E.coli under inducible control of the tac promoter, sedimentable inclusion bodies were produced. After purification on a sucrose density gradient, the inclusions were found to be composed of a 35-kDa polypeptide which cross reacted with Cry4B antiserum. Unlike the full length activated toxin which is soluble in carbonate/DTT buffer pH 10.5, the 35-kDa PPF protein was only soluble when this buffer was supplemented with 8M urea. After solubilisation in this buffer and dialysis to remove urea, the elution profile from size exclusion FPLC analysis indicated that this 35-kDa PPF protein appeared to be in a high molecular mass form (>300 kDa). This FPLC purified-PPF protein was able to release entrapped glucose from liposomes, whilst the full length Cry4B-activated toxin showed no release. However, the purified protein obtained was highly sensitive to tryptic digestion suggesting that it might not exist in the native folded conformation. When the PPF fragment was fused with the avidin affinity tag, the soluble form of the PPF fusion protein was purified via batch biotin-avidin binding method. In addition, tryptic digestion of the fusion PPF protein produced a relatively resistant fragment of 18 kDa, whose size and N- terminus were identical to those of the five-helix bundle (?1-?5) of the trypsin treated Cry4B toxin. Single proline substitutions were also employed to analyse the possible involvement of ?3 or ?4 in toxin activity of the Cry4B toxin. Point mutations were introduced near the middle of ?3 (V119P), at the N-terminus of ?4 (Q140P) or in the central region of ?4 (Q149P). E. coli cells expressing each type of the recombinant toxins were assayed for their relative toxicities against Aedes aegypti mosquito-larvae. The mortality data recorded after 24-hour incubation shows that the two mutants, V119P and Q140P, still exhibited high levels of activity, whereas Q149P gave only 2.8 ? 2.0% mortality when compared to the wild-type. Interestingly, the toxicity of E. coli cells expressing the wild-type toxin was significantly reduced by 2-hour pre-incubation with the non-toxic mutant, thus indicating that the primary binding step was not affected by the proline substitution in ?4. Data provided here reveals a crucial role for helix 4 of the Cry4B toxin in toxicity, possibly in membrane insertion and pore formation rather than in receptor recognition. Current experiments are directed toward using planar lipid bilayers to confirm the role of this putative transmembrane helix (?4) in the formation of a functional ion channel.

บรรณานุกรม :
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . (2541). กลไกการสอดแทรกและการทำให้เกิดรูรั่วที่ระดับโมเลกุลของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงของเชื้อแบซิลลัสทูริงจิเอนซิส.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . 2541. "กลไกการสอดแทรกและการทำให้เกิดรูรั่วที่ระดับโมเลกุลของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงของเชื้อแบซิลลัสทูริงจิเอนซิส".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . "กลไกการสอดแทรกและการทำให้เกิดรูรั่วที่ระดับโมเลกุลของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงของเชื้อแบซิลลัสทูริงจิเอนซิส."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2541. Print.
ชนันท์ อังศุธนสมบัติ . กลไกการสอดแทรกและการทำให้เกิดรูรั่วที่ระดับโมเลกุลของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงของเชื้อแบซิลลัสทูริงจิเอนซิส. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2541.