ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การผลิต Green Fluorescent Protein ในรา ~iAspergillus oryzae:~i:ผลกระทบของเอนไซม์โปรติเอส

หน่วยงาน ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การผลิต Green Fluorescent Protein ในรา ~iAspergillus oryzae:~i:ผลกระทบของเอนไซม์โปรติเอส
นักวิจัย : อนุวัฒน์ เตชะฤทธิ์
คำค้น : Aspergillus oryzae , Green Fluorescent Protein , Protein Secretion , Protease , Heterologous Protein , ~iASPERGILLUS ORYZAE~i , GREEN FLUORESCENT PROTEIN , PROTEIN SECRETION , PROTEASE , HETEROLOGOUS PROTEIN
หน่วยงาน : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2545
อ้างอิง : http://www.thaithesis.org/detail.php?id=2006
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

วิทยานิพนธ์นี้ได้นำ Green Fluorescence Protein (GFP) มาใช้เป็นแบบจำลองแทน Heterologous protein เพื่อใช้สำหรับศึกษาผลกระทบของเอนไซม์โปรติเอสต่อการสร้างและหลั่ง recombinant protein ในรา ~iA. oryzae~i โดยสร้าง พลาสมิด pUTGEP2.5 ที่มี Secretion Signal Amino acid (ssa) ของ cellobiohydrolase I จาก ~iTrichoderma reesei~i ต่อเชื่อมที่ N-terminal ของ ~igfp~i gene ที่ถูกควบคุมภายใต้การทำงานของ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (~igpd~i) promoter ของ ~iA. nidulans~i และส่งถ่ายพลาสมิด pUTGEP2.5 ร่วมกับ pOBT ที่มี phleomycin resistant gene เป็น selectable marker เข้าสู่โปรโตพลาสต์ของ ~iA. oryzae~i สายพันธุ์ดั้งเดิม (WT) และสายพันธุ์ที่บกพร่องต่อการสังเคราะห์เอนไซน์อัลคาไลน์โปรติเอส (U1638) และคัดเลือก transformants บนอาหาร Czapex Dox ที่มียา phleomycin เข้มข้น 125 (+,m)g/mL และ 200 (+,m)g/mL ตามลำดับ พบความถี่ของการเกิด tramsformant ของ ~iA. oryzae WT และ U1638 บนอาหารที่มียา phleomycin ในอัตรา 34 และ 49 transformants/ 10(6) โปรโตพลาสต์/50 ไมโครกรัมพลาสมิด ตามลำดับ pUtgep2.5 เมื่อนำ transformansts สามารถแทรกเข้าไปรวมกับ โครโมโซมของ transformants ทั้งสองสายพันธ์ และพบการเรืองแสงสีเขียวของ GFP ของ transformant ทั้งสองสายพันธุ์ ภายใต้กล้อง fluorescence microscope transformant ทั้งสองสายพันธุ์มีความเสถียรในการผลิต GFP protein เป็น 100% หลังจากเจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มียา phleomycin และ เมื่อตรวจสอบ ประสิทธิภาพในการผลิต GEP protein โดยนำ transformants ทั้งสองสายพันธุ์ ไปวิเคราะห์หาค่ากิจกรรมของเอนไซม์โปรติเอสและหาค่า fluorescence intensities พบว่ารา ~iA. oryzae~i U1638-GFP ผลิต extracellular GFP และ protease activity ได้สูงสุดที่ชั่วโมง 60 ได้ 22.15 U/g cell และ 7.5 U/mL ตามลำดับ และที่เวลาเดียวกัน ~iA oryzae~i WT-GFP ผลิต extracellular GFP และ protease activity ได้สูงสุดเพียง 3.93 U/g cell และ 33 U/mL ตามลำดับ เมื่อศึกษาผลกระทบของเอนไซม์โปรติเอสต่อการผลิต heterologous protein ของรา ~iA. oryzae~i WT-GFP ที่เจริญในสภาวะที่ไม่มีการกดดันการสังเคราะห์เอนไซม์ โปรติเอส (MSM medium) พบว่าปริมาณ extracellular GFP และเอนไซม์โปรติเอส ที่ชั่วโมงที่ 12 หลังย้ายลงใน MSM อาหารมีค่าเป็น 3.69 U/g cell และ 14.94 U/g cell ตามลำดับ ขณะที่เซลที่เจริญในอาหารที่มีสภาวะกดดัน การสังเคราะห์เอนไซม์โปรติเอสด้วย กลูโคส (MSM+2% glucose) พบว่ามี extracellular GFP และ protease เป็น 10.49 U/g cell และ 0.74 U/g cell ตามลำดับ แสดงว่าการลดการสังเคราะห์เอนไซม์โปรติเอสสามารถเพิ่มผลผลิตของ heterologous protein ที่ผลิตในรา ~iA. oryzae~i ได้ และเมื่อติดตามผลของ เอนไซม์โปรติเอสต่อการผลิต GFP ในรา ~iA. oryzae~i WT-GFP พบว่าในอาหาร MSM ปริมาณของ GFP ลดลงอย่างรวดเร็วเมื่อเทียบกับเซลที่เจริญในอาหาร MSM+2% glucose แสดงว่า GFP สามารถถูกย่อยทำลายด้วยเอนไซน์โปรติเอส ตั้งแต่ภายในเซลและพบว่าการส่ง GFP เกิดขึ้นเฉพาะส่วนปลายของ mycelium (tip) ของ ~iA. oryzae~i แสดงว่า intracellusar protease และ extracellusar protease เป็นตัวจำกัดการผลิตและส่ง heterologous protein ออกนอกเซลในรา ~iA. oryzae~i

บรรณานุกรม :
อนุวัฒน์ เตชะฤทธิ์ . (2545). การผลิต Green Fluorescent Protein ในรา ~iAspergillus oryzae:~i:ผลกระทบของเอนไซม์โปรติเอส.
    กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย.
อนุวัฒน์ เตชะฤทธิ์ . 2545. "การผลิต Green Fluorescent Protein ในรา ~iAspergillus oryzae:~i:ผลกระทบของเอนไซม์โปรติเอส".
    กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย.
อนุวัฒน์ เตชะฤทธิ์ . "การผลิต Green Fluorescent Protein ในรา ~iAspergillus oryzae:~i:ผลกระทบของเอนไซม์โปรติเอส."
    กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย, 2545. Print.
อนุวัฒน์ เตชะฤทธิ์ . การผลิต Green Fluorescent Protein ในรา ~iAspergillus oryzae:~i:ผลกระทบของเอนไซม์โปรติเอส. กรุงเทพมหานคร : ฐานข้อมูลวิทยานิพนธ์ไทย; 2545.