ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การศึกษาความจำเพาะต่อการสังเคราะห์โอลิโก-แมนโนไซด์ด้วยเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดส

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การศึกษาความจำเพาะต่อการสังเคราะห์โอลิโก-แมนโนไซด์ด้วยเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดส
นักวิจัย : ภัชราพร วงศ์วิฑูรยาพร
คำค้น : oligosaccharide synthesis , specificity property , การสังเคราห์โอลิโกแซคคาไรด์ , สมบัติความจำเพาะ , อัลฟา-แมนโนซิเดส , -Mannosidase
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2552
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=PDF4380042 , http://research.trf.or.th/node/5047
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

เอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดสเป็นเอนไซม์ที่มีบทบาทสำคัญในการเชื่อมแมนโนสกับโอลิโกแซคคาไรด์ในไกลโคโปรตีนโดยเฉพาะไกลโคโปรตีนชนิดที่เชื่อมต่อกับกรดอะมิโนแอสปาราจีน (N-linked glycoprotein) นอกจากนี้ เอนไซม์ชนิดนี้ยังมีความสำคัญในการนำไปใช้เพื่อการตรวจวิเคราะห์แมนโนสในโอลิโกแซคคาไรด์ รวมทั้งการนำไปสังเคราะห์โอลิโกแซคคาไรด์ที่มีแมนโนสเป็นองค์ประกอบ โครงการวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ของโครงสร้างของเอนไซม์และความจำเพาะต่อการสังเคราะห์โอลิโก-แมนโนไซด์ของเอนไซม์ เนื่องจากการศึกษาความสัมพันธ์ดังกล่าวจำเป็นต้องใช้เอนไซม์บริสุทธิ์ที่มีปริมาณมากพอต่อการศึกษาหลายปฏิกิริยา แต่เอนไซม์ที่สกัดแยกได้มีปริมาณน้อยมากๆ และไม่เสถียร (unstable) อีกด้วย ทำให้ผู้วิจัยไม่สามารถศึกษาความสัมพันธ์ดังกล่าวตามวัตถุประสงค์ได้ จึงได้ทำการศึกษาสมบัติทางกายภาพ จลนศาสตร์ และความจำเพาะต่อการสลายและการสังเคราะห์ของเอนไซม์แทน ได้สกัดและแยกเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดสจากเมล็ดกระเจี๊ยบแดง (Hibiscus sabdariffa L. var. sabdariffa) โดยวิธีการตกตะกอนโปรตีนแบบแยกลำดับส่วนที่ความเข้มข้นของเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต 30-80 เปอร์เซ็นต์ และตามด้วยโครมาโทกราฟฟีชนิดต่างๆ ได้แก่ โครมาโท-กราฟีแบบแลกไอออนชนิดเรซินเป็นประจุบวก (DEAE-52 cellulose) โครมาโทกราฟีแบบแลกไอออนชนิดเรซินเป็นประจุลบ (CM-52 cellulose) โครมาโทกราฟีแบบไฮดรอกซีแอบปาไทต์ (hydroxyapatite) และโครมาโทกราฟีแบบเจลฟิลเทรชัน (Sephacryl HR S-200 และ HR S-300) พบว่าเมล็ดกระเจี๊ยบแดงมีเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดส 2 ไอโซไซม์ โดยไอโซไซม์ชนิดที่ I จะมีค่าพีไอที่ 4.8 ขณะที่ไอโซไซม์ชนิดที่ II มีค่าพีไอที่ 4.9-6.0 ไอโซไซม์ทั้ง 2 ต้องการ Zn2+ ช่วยในการคงแอกทิวิทีของเอนไซม์เมื่ออยู่ในสารละลายที่มีค่าพีเอชเป็นกรด เนื่องจากไอโซไซม์ชนิดที่ II มีแอกทิวิทีต่ำมาก ไม่เพียงพอต่อการศึกษาต่อ จึงศึกษาสมบัติของไอโซไซม์ชนิดที่ I เท่านั้น จากเจลอิเล็กโทรโฟรีซิสชนิดเสียสภาพธรรมชาติ (SDS-PAGE) ได้แถบโปรตีน 2 แถบ มีน้ำหนักโมเลกุลที่ 69.6 และ 56.6 กิโลดาลตัน น้ำหนักโมเลกุลของเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดสในสภาพธรรมชาติอยู่ในช่วงระหว่าง 357-481 กิโลดาลตัน ไอโซไซม์ชนิดที่ I ถูกแยกจากไอโซไซม์ชนิดที่ II โดยการใช้โครมาโทกราฟีชนิดเรซินเป็นประจุลบ (CM-52 cellulose) ด้วยค่าพีเอชที่ 4.4 ที่มีซิงค์คลอไรด์ 1 มิลลิโมลาร์ และใช้เกรเดียนท์พีเอชแบบขั้นบรรได (step pH gradient) เริ่มจากพีเอช 4.4 ถึง 5.0 ด้วยการเว้นช่วงพีเอช 0.2 หน่วย ได้โปรตีน 1 แถบที่มีน้ำหนักโมเลกุล 69.6 กิโลดาลตัน จาก SDS-PAGE จากตัวอย่างไอโซไซม์ชนิดที่ I ขณะที่ไอโซไซม์ชนิดที่ II ไม่สามารถเห็นได้จาก SDS-PAGE เนื่องจากความเข้มข้นของโปรตีนต่ำมากๆ ดังนั้น ไอโซไซม์ชนิดที่ I ควรประกอบด้วยหน่วยย่อยชนิดเดียวกัน 6 หน่วย นอกจากนี้ ยังพบว่าไอโซไซม์ชนิดที่ I มีค่าพีเอชและอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการสลายสับสเตรทสังเคราะห์พารา-ไนโทรเฟนนิล-อัลฟา-ดี-แมนโนไพแรนโนไซด์ที่พีเอช 4.0-4.5 และ 60-70 องศาเซลเซียส ตามลำดับ ค่าทางจลนศาสตร์ Km และ Vmax ของไอโซไซม์ชนิดที่ I ต่อการสลายสับสเตรทสังเคราะห์พารา-ไนโทรเฟนนิล-อัลฟา-ดี-แมนโนไพแรนโนไซด์เท่ากับ 1.05 มิลลิโมลาร์ และ 0.36 ไมโครโมลต่อนาที ตามลำดับ เมื่อศึกษาการสังเคราะห์เบื้องต้นของโอลิโกแซคคาไรด์ที่มีแมนโนสด้วยเอนไซม์ที่แยกให้บริสุทธิ์เป็นบางส่วนจากโครมาโทกราฟีแบบไฮดรอกซีแอบปาไทต์ ซึ่งปราศจากเอนไซม์บีต้า-แมนโนสซิเดสและเอนไซม์ไกลโคสซิเดสหลักชนิดอื่นๆ ด้วยปฏิกิริยาการย้อนกลับการสลาย พบว่าเอนไซม์มีพีเอชและอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อปฏิกิริยาการสังเคราะห์แมนโนไบโอสที่ 4.0 และ 60 องศาเซลเซียส ตามลำดับ ซึ่งคล้ายคลึงกับค่าที่ได้จากปฏิกิริยาการสลาย นอกจากนี้ เมื่อนำเอนไซม์ (5 หน่วยเอนไซม์ / มิลลิลิตร) บ่มกับแมนโนส 50 เปอร์เซ็นต์ที่พีเอช 4.0 และ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3, 7 และ 10 วัน จะได้ Man(16)Man เป็นผลิตผลหลักเมื่อเทียบกับแมนโนไบโอสชนิดอื่นๆ ที่เกิดขึ้น คือ Man(12)Man, Man(13)Man และ Man(14)Man การวิเคราะห์โดยโครมาโทกราฟีแบบแผ่นเคลือบแสดงให้เห็นว่าไม่มีผลผลิตใดๆ จากตัวอย่างที่บ่มเอนไซม์กับแมนโนส 10 เปอร์เซนต์ และไซโลส 40 เปอร์เซนต์ หรือกลูโคส 40 เปอร์เซนต์ ณ สภาวะเหมาะสม ขณะที่ตัวอย่างที่บ่มเอนไซม์กับสับสเตรทแมนโนส 10 เปอร์เซนต์ และกาแลกโตสหรืออะราบิโนส 40 เปอร์เซนต์ จะให้ผลิตผลบางอย่างที่ไม่ทราบแน่ชัด จากผลการทดสอบปฏิกิริยาการสลายและการสังเคราะห์ของเอนไซม์ดังกล่าว สามารถสรุปได้ว่าเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดสจากเมล็ดกระเจี๊ยบแดงจัดอยู่ในเอนไซม์คลาสที่ II ของเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดสและในแฟมิลี่ที่ 38 ของเอนไซม์ไกลโคไซด์ไฮโดรเลส -Mannosidase is an enzyme with an important function in linking a mannose to oligosaccharides in glycoproteins especially in N-linked glycoprotein. Moreover, this enzyme has been important in applying to analysis of mannose in oligosaccharides and syntheses of oligosaccharides containing mannose. This project had aimed to investigate the relationship between the enzyme structure and its oligomanoside-synthetic specificity. Since this study needed much amount of pure enzyme for many reactions but very tiny pure enzyme was obtained and it was also unstable. So the investigator could not study according to the project objective. Investigation of the physical properties, kinetics, and hydrolytic and synthetic specificity of the enzyme was studied instead. The -mannosidases were extracted and purified from roselle seed (Hibiscus sabdariffa L. var. sabdariffa) by 30-80% ammonium sulfate fractionation and followed by various chromatographies, i.e., anion exchange (DEAE-52 cellulose) , cation exchange (CM-52 cellulose), hydroxyapatite, and gel filtration (Sephacryl HR S-200 and HR S-300) chromatographies. It was found that roselle seed contained 2 isozymes of -mannosidase in which the isozyme I had pI value of 4.8 whereas the isozyme II had the pI value of 4.9-6.0. Both isozymes required Zn2+ for retaining their activities while in the acidic solution. Since the isozyme II had very low activity, not enough for further study, the isozyme I was only studied for its properties. From denaturing gel electrophoresis (SDS-PAGE), two protein bands were obtained, having the molecular weight of 69.6 and 56.6 kDa. The native molecular weight of the -mannosidases is in the range of 357-481 kDa. The isozyme I was separated from the isozyme II by using anion exchange chromatography (CM-52 cellulose) with the pH value at 4.4 containing 1 mM ZnCl2 and running step pH gradient starting from pH 4.4 to 5.0 at the intervals of 0.2 pH unit. Single band having the molecular weight of 69.6 kDa was obtained from SDS-PAGE with the isozyme I sample. Whereas the isozyme II could not be seen due to its very less protein concentration. So the isozyme I should comprise of 6 identical subunits. Moreover, it was found that the isozyme I had optimal pH and temperature for hydrolysis of synthetic substrate, p-nitrophenyl--D-mannopyranoside, at pH 4.0-4.5 and 60-70C, respectively. The kinetic values, Km and Vmax, of isozyme I towards hydrolysis of such synthetic substrate, p-nitrophenyl--D-mannopyranoside, are 1.05 mM and 0.36 mol/min, respectively. When the preliminary syntheses of mannose-containing oligosaccharides with partially purified enzyme, free from -mannosidase and the other major glycosidases, from hydroxyapatite chromatography were studied using reverse hydrolysis reaction. It was found that the enzyme had optimal pH and temperature for mannobioses synthesis at 4.0 and 60C, respectively, similar to the values obtained from hydrolytic reaction. In addition, when incubated the enzyme (5 U/ml) for 3, 7 and 10 days with 50% mannose at pH 4.0 and 60C, Man(16)Man was the major product comparing to the other mannobioses, i.e., Man(12)Man, Man(13)Man and Man(14)Man. Analysis by thin-layer chromatography showed no product from the samples of enzyme incubated at optimal conditions with 10% mannose and 40% xylose or 40% glucose. Whereas the samples of enzyme incubated with 10% mannose and 40% either galactose or arabinose as substrates gave some unknown products. From the results of hydrolytic and synthetic reactions of enzyme, it can be summarized that the -mannosidases from roselle are in the class II of -mannosidases and in the family 38 of glycoside hydrolases.

บรรณานุกรม :
ภัชราพร วงศ์วิฑูรยาพร . (2552). การศึกษาความจำเพาะต่อการสังเคราะห์โอลิโก-แมนโนไซด์ด้วยเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดส.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ภัชราพร วงศ์วิฑูรยาพร . 2552. "การศึกษาความจำเพาะต่อการสังเคราะห์โอลิโก-แมนโนไซด์ด้วยเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดส".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
ภัชราพร วงศ์วิฑูรยาพร . "การศึกษาความจำเพาะต่อการสังเคราะห์โอลิโก-แมนโนไซด์ด้วยเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดส."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2552. Print.
ภัชราพร วงศ์วิฑูรยาพร . การศึกษาความจำเพาะต่อการสังเคราะห์โอลิโก-แมนโนไซด์ด้วยเอนไซม์อัลฟา-แมนโนสซิเดส. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2552.