ridm@nrct.go.th   ระบบคลังข้อมูลงานวิจัยไทย   รายการโปรดที่คุณเลือกไว้

การศึกษากลไกการทำงานของฟลาโวโปรตีนที่ใช้ออกซิเจนในปฎิกิริยา

หน่วยงาน สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย

รายละเอียด

ชื่อเรื่อง : การศึกษากลไกการทำงานของฟลาโวโปรตีนที่ใช้ออกซิเจนในปฎิกิริยา
นักวิจัย : พิมพ์ใจ ใจเย็น
คำค้น : enzyme kinetics , enzyme mechanism , Flavin Flavoprotein , Hydroxylase , hydroxyphenylacetate , luciferase , monooxygenase , pre-steady state kinetics , reducatse
หน่วยงาน : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย
ผู้ร่วมงาน : -
ปีพิมพ์ : 2551
อ้างอิง : http://elibrary.trf.or.th/project_content.asp?PJID=RMU4880028 , http://research.trf.or.th/node/4451
ที่มา : -
ความเชี่ยวชาญ : -
ความสัมพันธ์ : -
ขอบเขตของเนื้อหา : -
บทคัดย่อ/คำอธิบาย :

โครงการวิจัยโครงการนี้ได้รับทุนสนับสนุนจากสำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย (สกว.) ตั้งแต่ปี พศ. 2548-2551 เพื่อทำการศึกษาวิจัยเอนไซม์ในกลุ่มที่มีฟลาวินเป็นโคแฟคเตอร์ (flavoenzymes) โดยได้ศึกษาเอนไซม์สามตัวด้วยกันคือ เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส (p-hydroxyphenylacetate hydroxylase, HPAH), เอนไซม์ไพราโนสออกซิเดส (pyranose oxidase, P2O) และเอนไซม์ลูซิเฟอเรส (bacterial luciferase, Lux) เอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซีเตทไฮดรอกซีเลส (p-hydroxyphenylacetate hydroxylase, HPAH) เป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาการเติมหมู่ไฮดรอกซี (Hydroxylation) ให้กับสารตั้งต้น p-hydroxyphenylacetate (HPA) ทำให้ได้สารผลิตภัณฑ์คือ 3,4-dihydroxyphenylacetate (DHPA) เอนไซม์นี้ประกอบด้วยเอนไซม์สองส่วนที่ไม่ได้ยึดติดกัน ส่วนแรก (Reductase component; C1) เป็นเอนไซม์ที่ใช้ฟลาวินเป็นโคแฟคเตอร์ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาการรับอิเลคตรอนเพื่อผลิตรีดิวซ์ FMN (reduced flavin mononucleotide; FMNH-) ให้กับส่วนที่สอง (Oxygenase component; C2) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยา Hydroxylation จากการศึกษาจลนพลศาสตร์พบว่าเอนไซม์ C2 จะจับกับ FMNH- (reduced form) เป็นอันดับแรกก่อนที่จะเกิดปฏิกิริยาต่างๆในลำดับถัดมา จากการศึกษาพบว่าเอนไซม์ C2 สามารถจับกับ FMNH- ได้แน่น (Kd = 1.2 µM) และรวดเร็ว (Kon > 107 M-1s-1) ปัจจุบันได้มีข้อมูลทางโครงสร้างสามมิติจากการตกผลึกของเอนไซม์ C2 ในรูปแบบ 3 ลักษณะคือเอนไซม์ C2 (apoenzyme), C2 จับกับ FMNH- (C2: FMNH-) และ C2 จับกับ FMNH-และ HPA (C2: FMNH-: HPA) พบว่าโครงสร้างสามมิติของ C2 มีลักษณะคล้ายกับเอนไซม์ในกลุ่ม acyl CoA dehydrogenase เมื่อเปรียบเทียบโครงสร้าง 3 มิติทั้ง 3 รูปแบบของ C2 พบว่าโครงสร้างหลักไม่มีความแตกต่างกันเลย เมื่อเปรียบเทียบระหว่าง C2: FMNH- และ C2: FMNH-: HPA พบว่า เมื่อมี HPA เข้ามาจับกับ C2: FMNH- หมู่แขนงของกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีนที่ตำแหน่ง 266 มีการหมุนตัวเพื่อยอมให้ HPA เข้ามาจับในบริเวณที่มีการเร่งปฏิกิริยา (active site) จากการศึกษาการทำงานร่วมกันระหว่างเอนไซม์ C1 และ C2 พบว่าหลังจากที่ FMN ซึ่งเป็นโคแฟคเตอร์ของ C1 ถูกรีดิวซ์ด้วย NADH แล้ว FMNH- จะถูกส่งถ่ายจากเอนไซม์ C1ไปยัง C2 เมื่อมีการใช้โปรตีน cytochrome c เป็นตัวแย่งรับ FMNH- จาก C1: FMNH- พบว่า ถึงแม้จะมีเอนไซม์ C2 ในปริมาณมาก C2 ยังไม่สามารถปกป้อง FMNH- จาก cytochrome c ได้ ดังนั้นจึงสรุปได้ว่าการส่งถ่าย FMNH- จากเอนไซม์ C1ไปยัง C2 เป็นแบบการแพร่ซึ่งไม่ต้องอาศัยการจับกันระหว่างเอนไซม์ C1 และ C2 ภายหลังจากเสร็จสิ้นการเกิด Hydroxylation ของเอนไซม์ C2 แล้ว FMN จะถูกส่งกับมายังเอนไซม์ C1 ตามเดิม เอนไซม์ไพราโนสออกซิเดส (pyranose oxidase; P2O) เป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่ในการเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชั่นของน้ำตาลกลูโคสและกลุ่มของน้ำตาล pyranose ตัวอื่นๆที่คาร์บอนตำแหน่งที่ 2 ซึ่งได้น้ำตาลที่อยู่ในรูปของคีโตน (2-keto sugar) เป็นสารผลิตภัณฑ์ ปฏิกิริยาที่เร่งด้วย P2O ถือว่าเป็นปฏิกิริยาที่มีความสำคัญมากในการสร้างสารจำพวกคาร์โบไฮเดรตเนื่องจากน้ำตาลที่อยู่ในรูปของคีโตนสามารถนำไปใช้ในการผลิตสารเคมีหลายตัวที่เป็นประโยชน์ในทางอุตสาหกรรม กลุ่มวิจัยของเราเป็นกลุ่มแรกที่สามารถตรวจวัดสารตัวกลาง C(4a)-hydroperoxyflavin ในปฏิกิริยาของเอนไซม์ไพราโนสออกซิเดส และเป็นครั้งแรกที่มีการพบสารตัวกลางประเภทนี้ในเอนไซม์จำพวก flavoprotein oxidase อีกด้วย นอกจากน้ำตาลในกลุ่ม pyranose แล้วเรายังพบว่า P2O สามารถใช้ 2-fluoro-D-glucose หรือ 2-deoxy-D-glucose เป็นสารตั้งต้นได้อีกด้วย จากผลการศึกษาดังกล่าวทำให้เราทราบว่า P2O สามารถเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชั่นของน้ำตาลในกลุ่ม pyranose ที่คาร์บอนตำแหน่งที่ 2 และ 3 เอนไซม์ลูซิเฟอเรส (bacterial luciferase; Lux) จากเชื้อแบคทีเรียเป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของออกซิเจน รีดิวซ์ฟลาวิน (FMNH-) และอัลดีไฮด์ (aldehyde) ทำให้ได้มาซึ่งสารผลิตภัณฑ์ กรดไขมัน (fatty acid) ออกซิไดซ์ฟลาวิน (FMN) น้ำ และเปล่งแสงสีเขียวแกมน้ำเงินออกมา เราได้ทำการคัดแยกสายพันธุ์ของแบคทีเรียที่มีเอนไซม์ Lux จากบริเวณชายฝั่งทะเลทางตอนใต้ของประเทศไทย และได้แบคทีเรีย Vibrio campbellii ซึ่งสามารถผลิตเอนไซม์ Lux ได้ และยังไม่เคยมีรายงานถึงการค้นพบดังกล่าวมาก่อน เราจึงได้โคลนและทำการแสดงออกของยีน Lux จากเชื้อแบคทีเรียชนิดนี้ในแบคทีเรีย E. coli จากการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์นี้พบว่าสามารถทนความร้อนได้ดีและสามารถเร่งปฏิกิริยาได้ดีกว่าเอนไซม์ Lux ที่เคยมีรายงานมาก่อน นอกจากนี้เรายังทำการคัดแยกโปรตีน LuxG จากแบคทีเรีย Photobacterium leonathi TH1 โดยกลุ่มของเราเป็นกลุ่มแรกที่โคลนและทำการแสดงออกของยีน LuxG ในแบคทีเรีย E. coli ซึ่งสามารถผลิตโปรตีน LuxG และ LuxG ที่มีกรดอะมิโนฮิสทิดีนติดอยู่ที่ปลาย C-terminus และได้ทำให้โปรตีนทั้งสองรูปแบบบริสุทธิ์โดยการใช้เทคนิคทางโครมาโตกราฟี จากการศึกษาคุณลักษณะของโปรตีน LuxG พบว่าสามารถทำหน้าที่เป็นเอนไซม์ฟลาวินรีดักเทส (flavin reductase) ที่ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยารีดักชั่นของฟลาวิน (FMN, FAD และ riboflavin) โดยใช้อิเล็กตรอนจาก NADH นอกจากนี้จากการศึกษาการทำงานร่วมกันของเอนไซม์ Lux และเอนไซม์ LuxG พบว่า LuxG สามารถที่จะผลิต FMNH- ที่เป็นสารตั้งต้นให้กับเอนไซม์ Lux ได้ Our research supported by TRF during 2005-2008 has focused on studying three flavoenzymes, A) p-hydroxyphenylacetate (HPA) hydroxylase (HPAH), B) pyranose oxidase (P2O), and C) bacterial luciferase (Lux). A) HPAH catalyzes hydroxylation of HPA to yield 3,4-dihydroxyphenylacetate. The enzyme is composed of two components, a small reductase (C1) and a larger oxygenase (C2). Investigation by transient kinetics shows that C2 binds to reduced FMN (FMNH–) as the first and mandatory step of the reaction before the following steps can occur, and this binding is very fast and tight, with kon > 107 M-1s-1 and Kd = 1.2 μM. The three dimensional structures of C2 in three forms, apo C2, C2-FMNH–, and C2-FMNH–-HPA, were solved. The overall protein folding of C2 is similar to enzymes in the class of acyl CoA dehydrogenase. Major structural difference between the three forms of C2 was not detected. The only difference found when the structures of C2-FMNH– and C2-FMNH--HPA are compared is the rotation of the side chain of F266 upon HPA binding. Investigation by rapid kinetics has shown that, after the flavin is reduced on C1, the resulting FMNH– is transferred to C2 and then returns to C1 in the oxidized form after completion of the hydroxylation reaction. It was found that C2 in large excess cannot protect or alter the kinetics of the cytochrome c reduction by C1-FMNH–. All data we obtained suggest that no complex is formed between C1 and C2. Protein-protein interactions between C1 and C2 are not necessary for efficient transfer of FMNH–. B) P2O catalyzes oxidation of D-glucose or other pyranoses at the C2 position, resulting in the corresponding 2-keto sugars as products. The reaction catalyzed by P2O is regarded as one of the most useful types for carbohydrate syntheses because 2-keto-sugars can be used in chiral syntheses of valuable compounds. One of our major findings of this project is the detection, for the first time, of a C4a-hydroperoxy flavin intermediate in the reaction of flavoprotein oxidase. We also found that P2O can use 2-fluoro-D-glucose or 2-deoxy-D-glucose as slow substrates, indicating that the enzyme can catalyze oxidation of pyranose sugars at both the 2-position and 3-position. C) Bacterial luciferase (Lux) is an enzyme catalyzing the reaction of O2 with FMNH– and a long-chain aliphatic aldehyde, and resulting in FMN, water and a fatty acid, with concomitant emission of blue-green light. We isolated a novel bacterial luciferase from Vibrio campbellii (from marine samples in Thailand) and expressed it in E. coli. The new enzyme is heat-stable and more efficient in catalyzing reaction than the existing bacterial luciferases. We are the first group to report the cloning and overexpression of the luxG gene in E. coli. The gene was isolated from Photobacterium leiognathi TH1, a bacterium isolated from marine samples in Thailand. The gene products (LuxG), one without a tag and the other with a his6 tag at the C-terminus, were purified to homogeneity and characterized for their enzymatic properties. We have shown that LuxG is a flavin reductase that catalyzes reduction of flavins (FMN, FAD, and riboflavin) by NADH, and it could be coupled in vitro with the luciferases from P. leiognathi TH1 and V. campbellii to produce luminescence.

บรรณานุกรม :
พิมพ์ใจ ใจเย็น . (2551). การศึกษากลไกการทำงานของฟลาโวโปรตีนที่ใช้ออกซิเจนในปฎิกิริยา.
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
พิมพ์ใจ ใจเย็น . 2551. "การศึกษากลไกการทำงานของฟลาโวโปรตีนที่ใช้ออกซิเจนในปฎิกิริยา".
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย.
พิมพ์ใจ ใจเย็น . "การศึกษากลไกการทำงานของฟลาโวโปรตีนที่ใช้ออกซิเจนในปฎิกิริยา."
    กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย, 2551. Print.
พิมพ์ใจ ใจเย็น . การศึกษากลไกการทำงานของฟลาโวโปรตีนที่ใช้ออกซิเจนในปฎิกิริยา. กรุงเทพมหานคร : สำนักงานกองทุนสนับสนุนการวิจัย; 2551.